| Project/Area Number |
23K23614
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| Project/Area Number (Other) |
22H02349 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 39040:Plant protection science-related
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
八丈野 孝 愛媛大学, 農学研究科, 教授 (10404063)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉田 健太郎 京都大学, 農学研究科, 教授 (40570750)
久野 裕 岡山大学, 資源植物科学研究所, 准教授 (70415454)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,680,000 (Direct Cost: ¥13,600,000、Indirect Cost: ¥4,080,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2022: ¥8,970,000 (Direct Cost: ¥6,900,000、Indirect Cost: ¥2,070,000)
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| Keywords | オオムギうどんこ病菌 / カルシウムスパイク / 絶対寄生 / mlo / カルシウムイオン / 半活物寄生 |
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| Outline of Research at the Start |
オオムギうどんこ病菌の侵入時にカルシウムイオンの流入が引き起こされるが、そのメカニズムはわかっていない。GCaMP6fを活用した時空間的解析を行なった結果、侵入時にカルシウムスパイクが形成されること、膜貫通タンパク質であるMLOがその制御に関与することが明らかとなった。MLOに相互作用するタンパク質群を同定し、相互作用及びカルシウムスパイク制御の分子メカニズムの解明に取り組んだ。
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| Outline of Annual Research Achievements |
オオムギうどんこ病菌の抵抗性遺伝資源としてmlo変異体が長らく使用されてきたが、MLOの分子機能については不明な点が多い。近年、シロイヌナズナにおいて花粉管の研究によりMLOオルソログがカルシウムイオンチャネルとして機能することが報告された（Gao et al., 2022）。MLOのC末端にカルモジュリン結合ドメインがあり、細胞内カルシウムイオン濃度に依存してカルモジュリンとの結合が促進されることでチャネルの活性化が制御されると想定される。また、本研究において、MLOと協調してカルシウムイオンの流動を調節すると推定される相互作用タンパク質を単離しており、そのタンパク質のN末端にもカルモジュリン結合ドメインが存在する。そのため、１細胞レベルで細胞内カルシウムイオンの増減を可視化するためのGCaMP6f形質転換体を作成した。野生型とmlo変異体においてカルシウムイオンの流入を比較したところ、野生型ではカルシウムイオンスパイクを示したのに対して、mlo変異体ではスパイク形成が見られなかった。１細胞でのカルシウム流入をモニターする実験系を構築することはできたため、自動で複数箇所の１細胞をタイムラプス撮影することにより統計学的な解析を行えるように実験系をさらに改善している。１層の表皮細胞層をバッファー上に浮かべながら数時間連続して撮影するため、バッファーの蒸発による焦点のずれ及び感染行動への影響が出ることが明らかとなった。そのため、蒸発する速度に合わせたバッファー供給が必要であると考え、バッファーの自動供給システムを構築して蛍光顕微鏡に実装した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
カルシウムイオンの流入をリアルタイムに可視化して解析する実験系を構築することができている。より高精度のデータを得るためには多点を同時に記録する必要があると考えられたため、蛍光撮影を自動化した顕微鏡システムをセットアップしたが、励起光の照射時間が長くなることに起因した熱の発生、バッファーの蒸発促進により、焦点のずれが生じることが明らかになった。その問題を解決するためのバッファー自動供給システムをすでに構築して改善している。mlo変異体に対して、種々のアレルを相補することでカルシウムイオンチャネルとしての機能を明らかにするための実験系として、レーザー熱膨張式マイクロインジェクション技術を取り入れるが、その実験系についてはすでに確立している。タイムラプス撮影を安定して行えるようになってきたため、次年度で統計学的データを取得する準備ができている。
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| Strategy for Future Research Activity |
安定的にカルシウムイオンの流入をバイオイメージングできるmlo/GCaMP6f形質転換体を用いて、１細胞レベルで一過的にMLO機能相補実験を行い、統計学的に解析する。MLOによるカルシウムイオン流入を制御する因子として、MLO相互作用タンパク質をすでに単離しているため、カルモジュリンとの結合を含め、カルシウムスパイク形成の制御メカニズムを明らかにする。
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