| Project/Area Number |
23KJ1683
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 40040:Aquatic life science-related
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
松井 信太郎 九州大学, 農学研究院, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2023-04-25 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 血液凝固 / factor XII / HGFA |
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| Outline of Research at the Start |
哺乳類の血液はプラスチック等によりプロテアーゼ前駆体のfactor XIIが自己活性化（分解）され、凝固が起こる。多くの真骨魚類はfactor XIIを持たないが、その血液はシリンジ内で急激に凝固する。このことは、真骨魚類がfactor XIIに依らない未知の血液凝固系を有することを意味する。
本研究では、まずプラスチックなどにより自己活性化するタンパク質を特定する。次に、その因子を精製、活性化させた後に、これをコイの血漿に加え、分解を受けるタンパク質を同定する。以後、この手順をフィブリノゲン分解酵素が見出されるまで繰り返す。これにより新奇血液凝固カスケードの全容が解明されるものと期待される。
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類の血液凝固はExtrinsic PathwayとContact Pathwayという2つの系により起こる。Contact Pathwayはプロテアーゼ前駆体のFactor XIIがRNAやコラーゲン、ポリリン酸などの陰性電荷を帯びた分子と結合し、自己活性化されることで開始される。硬骨魚類においては、factor XII遺伝子が存在しないにも関わらず、Contact Pathway様の活性が認められる。このことは硬骨魚類がContact Pathway 様の新奇血液凝固カスケードを有することを意味する。本研究ではその具体的なカスケードの決定を目指した。本年度は、血液凝固開始因子の同定を行った。すなわちFactor XIIに代わる因子として、そのホモログであるHepatocyte Growth Factor Activator (HGFA)と仮定し、その精製を試みた。
コイの血漿をHeparin-SepharoseおよびPOROS-HQ20で分画した後、ヒトHGFA分解プロテアーゼのトロンビンをそれぞれの画分に加え、トロンビン添加の有無でSDS-PAGEのバンドパターンに変化が生じるか調べた。その結果、複数のタンパク質の分解が認められた。
哺乳類細胞を用いた系(HEK293T系)を用いて、組み替え体コイHGFAの作製に取り組んだ。哺乳類細胞用のコイHGFAの配列を挿入した発現ベクターを調製した。その後、ポリエチレンイミン (PEI-MAX)を用いて、リポフェクションを行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度の実験で、コイ血漿中からHGFAの候補となるバンドを特定した。これらのタンパク質はすでに2ステップのクロマトグラフィに供したものであり、比較的純度も高く完全精製に近い状態にある。そのため、次年度即座にHGFAの機能試験を行うことが可能であり、今後の研究に大きく役立つ成果が得られたものと判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度の実験で、トロンビンによって分解されることが認められたタンパク質をLC-TOF MS解析により同定する。その中からHGFAと一致するペプチド配列が得られた場合、そのタンパク質が得られた画分を用いてゲル濾過クロマトグラフィ等を行い、HGFAの完全精製を目指す。さらに、精製HGFAにコラーゲンなどの接触系開始因子を加え分解されるか、すなわち自己活性化能を示すかを試験する。
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