| Project/Area Number |
24K09512
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 44040:Morphology and anatomical structure-related
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
市原 健介 北海道大学, 北方生物圏フィールド科学センター, 助教 (60610095)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2028-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2027: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2026: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 有性生殖 / 性決定遺伝子 / 海藻 / ゲノム編集 / 性染色体 |
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| Outline of Research at the Start |
有性生殖は多様性を維持する有効なシステムであり、性を決める機構の解明は多くの研究者が取り組んできたテーマである。本テーマの材料となる緑色海藻アオノリでは、配偶体自体には性差はなく、構造的な性差は配偶子の時にのみ、鞭毛と接合装置に集約された非常に僅かな形で表出する。これまでの研究から、アオノリゲノムには性染色体領域があり、雄特異的領域には転写因子が見つかっていた。本研究では、緑藻スジアオノリを材料に、発現遺伝子解析とゲノム編集技術を組み合わせることで、この起源的な微小な性差を生み出す構造タンパク質群とその発現をコントロールする性決定遺伝子の発見を目的とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
有性生殖は遺伝子の多様性を維持するための有効なシステムであり、個体の性を決めるシステムの解明は古くから多くの研究者が取り組んできたテーマである。本テーマの材料となる緑色海藻アオノリでは、配偶体自体には性差はなく、構造的な性差は配偶子の時にのみ現れ、それも鞭毛と接合装置にのみに集約された非常に僅かなものしかない。これまでの研究から、アオノリゲノムには性染色体領域があり、雄特異的領域には転写因子RWP1が見つかっていた。本研究では、雄の性染色体上に存在する転写因子RWP1の機能を解析することで、単純な生殖細胞をもつアオノリにおける雌雄配偶子の構造的差異がどのようにコントロールされているのかを明らかにすることを目標とする。
今年度は、まず実施者が構築したCRISPR/Cas9 RNPによるゲノム編集手法を用いて、RWP1のノックアウト（KO）変異体の作出を試みた。実験の結果、異なる変異箇所を有する複数のKO株を作出することに成功した。作出したKO株は、配偶子誘導を行い、配偶子が泳ぎ出てくると、驚くべきことに、自家接合のような表現型を示し、雌株と混合することなく、接合子様の細胞を作ることがわかった。クラミドモナスやボルボックスでは雄性決定遺伝子であるMIDを破壊すると、雌様になるが、同じUV型の性染色体を持つにも関わらす、その性決定の機構は大きく異なっていることが示唆される結果となった。
また透過型電子顕微鏡で、雌雄配偶子とKO配偶子の微細構造を比較したところ、KO配偶子では形態的な大きな変化が観察された。雌雄の配偶子では接合装置と呼ばれる接合の際に、細胞融合の起点となる部位があるが、雄では眼点と反対の面に、雌では眼点と同一の面にあることが知られている。KO配偶子では、これが雌型の配置となっており、RWP1を破壊することで、構造的な性差が反転してしまうことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
ゲノム編集実験がスムーズに進み、標的遺伝子RWP1のKO変異体を複数株得ることができた。また実験の過程で、標的遺伝子に対する複数のCas9 RNPを使用することで3kb以上の長い欠損を任意の箇所で生じさせることが可能であることもわかった。
得られたKO変異体の表現型は、当初予想された、”単純な雌化”とは異なり、自己を異性として認識し接合してしまう、いわゆるホモタリック的な生殖様式を示すものであった。これはUV染色体による性決定システムの多様性を提示するような結果であると言える。
KO個体が得られたことから、現在はノックイン（KI）変異体の作出のためのプラスミド作成および、条件検討をすでに開始できており、想定よりも早く研究計画を進めることができている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、当初の想定取り実験を進める予定である。今年度は得られたKO個体のRNAseq解析を行い、遺伝子発現がどのように変化しているのかを明らかにする。また、スジアオノリに関しては、性染色体領域が完全につながっているゲノムデータが現在までのところ、得られていないことから、今年度新たにゲノムのシーケンスを行い、高精度のゲノムデータを整備する予定である。
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