| Project/Area Number |
24K11768
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55010:General surgery and pediatric surgery-related
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
連 利博 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 客員研究員 (20140444)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
家入 里志 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (00363359)
大西 峻 鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 講師 (10614638)
杉田 光士郎 鹿児島大学, 鹿児島大学病院, 特任助教 (50781514)
宮澤 正顯 近畿大学, 医学部, 教授 (60167757)
尾藤 祐子 神戸大学, 医学部附属病院, 特命教授 (60719003)
桝屋 隆太 愛媛大学, 医学部附属病院, 講師 (90448572)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2026: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 胆道閉鎖症 / maternal microchimerism / サイトカイン / 胆管上皮細胞 / GvHD / 母親由来細胞キメリズム |
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| Outline of Research at the Start |
当研究グループはこれまでに胆道閉鎖症患者に母親由来細胞のキメラ状態が存在することを示し、BAは母親由来effector T 細胞によるGraft-versus-Host Disease（GvHD）様の免疫関連疾患であると考え、臨床所見を報告してきた。自己免疫疾患様のBA発症メカニズムについて、母親細胞はBA患児胆管上皮に対して組織特異的活性化反応を起こしうるかを見極めるのが本研究の学術的問いである。本研究では、母親由来細胞が胆管上皮の抗原に特異的に反応するかどうかを検討し、BA発症メカニズムがMMｃと直接関連するかを検証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
胆道閉鎖症（ＢＡ）は生後に肝内外の胆管閉塞や門脈圧亢進が進行する新生児肝疾患で、なんらかの免疫異常に起因する胆道系のみの炎症性疾患であり、その原因は未だ不明である。本研究の目的は、胎児期に迷入した母親由来の免疫担当細胞（Maternal Microchimerism）の存在下に患児の胆管上皮細胞のみが出生前後に破壊されるとする仮説の妥当性を検証することである。
方法としては、母親由来細胞の胆管組織傷害の直接的関与の有無を胆管上皮以外の上皮細胞と比較検討する。Tリンパ球が認識するのはMHC分子上に提示された短いペプチドとしてのアミノ酸配列であり、ホルマリン固定パラフィン切片でも保たれているので、BAにおける胆管上皮細胞抗原が自己のリンパ球、または母親由来のリンパ球を刺激しうるかを検討する。
予備実験として、BA肝の生検組織のホルマリン固定・パラフィン包埋ブロックより厚さ20μｍの切片５枚ずつを採取し、培地に浮遊させ、母親および患児自身から得られた末梢単核球3x107個の浮遊液500μlを対照として頬粘膜擦過細胞浮遊液を加えて48時間培養する。上清を回収して、サイトカイン（IFN-γ, IL-6, IL-17a）の活性化をサンドイッチ法にて既知濃度の標準濃度吸光度曲線にて測定した絶対濃度を指標とし、また、抗ヒトCD４、CD8、CD25, CD103、CD69抗体により多色蛍光染色を施して、フローサイトメトリーにて評価する。
上記の切片刺激実験系が機能することを確認した上で、次に、本試験として、患児肝の切片からレーザーマイクロダイセクション法で胆管部分だけを切り出し、胆管上皮細胞を母親及び患児末梢血単核球の刺激抗原として用いる。活性化する細胞は母親および患児の末梢血リンパ球とし、それぞれ頬粘膜擦過細胞を抗原とした同様の組み合わせを対照として４組で比較検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本大学の倫理委員会審査に多大な時間を要し、開始できなかったことが大きな要因である。４月中旬になって承認されたので、今後迅速に開始する予定である。
その間、レーザーマイクロダイセクションは経験豊富な近畿大学病理学教室 伊東彰彦教授と実質的な会議を行い、協力いただけることになっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
対照組織として頬粘膜細胞が適切かどうかは不明である。そこで、本試験の最終段階として、前向きに共同研究者の病院（神戸大学小児外科、兵庫県立こども病院、茨城県立こども病院）にて研究期間中に手術が行われた症例から得られた組織を対象とし、対照は頬粘膜細胞ではなく、術中に得られたルーＹ脚空腸断端の粘膜細胞を抗原とし、同様のプロトコールで解析する。
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