ヒルシュスプルング病類縁疾患モデルゼブラフィッシュを用いた新規治療法開発

• Project/Area Number: 24K11786
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 55010:General surgery and pediatric surgery-related
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 近藤 琢也 九州大学, 医学研究院, 助教 (00644725)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 日高 京子 北九州市立大学, 基盤教育センター, 教授 (00216681) ; 永田 公二 九州大学, 大学病院, 講師 (20419568) ; 張 秀英 九州大学, 医学研究院, 学術研究員 (50914173) ; 大野 みずき 九州大学, 医学研究院, 助教 (70380524) ; 田尻 達郎 九州大学, 医学研究院, 教授 (80304806)
• Project Period (FY): 2024-04-01 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2026: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: ゼブラフィッシュ / 巨大膀胱短小結腸腸管蠕動不全症 / lmod1 / ヒルシュスプルング病類縁疾患 / iPS細胞

Outline of Research at the Start

巨大膀胱短小結腸腸管蠕動不全 は生命予後50%程度の希少難治性疾患である。
平滑筋収縮に関わる遺伝子変異が原因遺伝子として同定されているが、詳細な機序は明らかになっていない。
ヒト多能性幹細胞を用いて腸管平滑筋細胞を含む腸管オルガノイドを作成し、ACTG2、LMOD1を標識した腸管平滑筋細胞をFACS解析し、疾病要因を同定する。また、上記で得られた疾病要因から治療薬となりうる候補薬剤を選定した後に、ヒルシュスプルング病類縁疾患　モデルゼブラフィッシュに投薬して、腸管機能を評価し、薬剤効果判定をおこなう。

Outline of Annual Research Achievements

ヒルシュスプルング病類縁疾患の1つに腸管壁内神経節細胞が正常であるにも関わらず、腸蠕動障害を認める巨大膀胱短小結腸腸管蠕動不全症(MMIHS)があり、消化管平滑筋の機能喪失が関与するmyopathyであるといわれている。筋肉の先天的欠損もしくは発生異常を伴うゼブラフィッシュモデルを作成し、評価することで、筋肉の発生機序に関する分子メカニズムをin vivoで解明し、最終的には新たな薬剤プラットフォームを作成することで新規治療法開発を目標としている。
平滑筋形成不全モデルとして、平滑筋構造に関わるlmod1遺伝子をターゲットとした。lmod1ノックアウトゼブラフィッシュを作成し、腸蠕動の低下だけでなく、acta2、myh11、myod1といった平滑筋関連遺伝子の発現も低下することを示した。現在、lmod1ノックアウトモデルの育成・継代を行っている。
また、腸管不全合併肝障害(IFALD)の解明の一環として、理化学研究所よりオートファジー活性を測定できるプローブが導入されたゼブラフィッシュを購入した。lmod1ノックアウトモデルと交配させ、IFALDゼブラフィッシュモデルを作成、評価していく予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

lmod1ノックアウトモデルの育成・継代において、産卵・孵化・稚魚育成過程を経る必要から、そのサイクルに応じた時間が各世代で必要となるため。また、F2世代の稚魚は致死率が高く、安定した継代が可能となったとはいえず、生存した稚魚においてもphenotypeの確認に時間を要している。

Strategy for Future Research Activity

平滑筋形成不全モデルにおいては、lmod1ノックアウトモデルの育成・継代を行い、homozygousモデルの作成を行う。homozygous個体で腸管蠕動を評価するとともにqPCRやWestern blotで平滑筋関連遺伝子・タンパク質の発現への影響の有無、免疫蛍光染色を用いて病理学的にも評価する。その後、homozygousに対してGFPを標識したlmod1を遺伝子導入し、致死率の改善、腸蠕動の評価、病理学的評価を行うことでlmod1は遺伝子治療の標的となりうるか検討する予定である。
IFALDモデルにおいてはlmod1ノックアウトモデルとオートファジーモデルを交配し、腸蠕動評価や病理学的評価を行うことでIFALDの原因はオートファジーか検討する予定である。