オルガネラ機能の再構成による細胞オペレーション技術の創出

• Project/Area Number: 24K21340
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 90:Biomedical engineering and related fields
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 安藤 満 京都大学, 医生物学研究所, 助教 (70737460)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐々木 善浩 京都大学, 工学研究科, 教授 (90314541)
• Project Period (FY): 2024-06-28 – 2028-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥26,000,000 (Direct Cost: ¥20,000,000、Indirect Cost: ¥6,000,000); Fiscal Year 2027: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2026: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2025: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2024: ¥10,400,000 (Direct Cost: ¥8,000,000、Indirect Cost: ¥2,400,000)
• Keywords: ミトコンドリア / イオンチャネル / ATP合成酵素 / 脂質膜被覆微粒子 / オルガネラ機能再構成 / 膜タンパク質 / 無細胞タンパク質合成 / ハイブリッド粒子 / エネルギー産生

Outline of Research at the Start

本研究ではミトコンドリア機能の中でエネルギー産生だけに特化し、膜タンパク質の持つ分子選択性と反応効率を最大限生かして、膜電位変化から化学エネルギーへ逐次変換することにより、細胞内でエネルギー産生することが可能な人工ミトコンドリアの構築と、ミトコンドリア移植に替る細胞機能の増強技術の創出に挑戦する。ミトコンドリア機能を再構成することで天然のミトコンドリアとは異なり生死から切り離すことが可能である。この方法論が可能となれば、細胞機能を高めるための新たな技術が確立され、機能の高い細胞を人為的に調製することができる。

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、ミトコンドリア機能の中でエネルギー産生に着目し、エネルギー産生に関わる膜タンパク質を微粒子表面に再構成することでエネルギー産生機構を模倣した微粒子を創出する。ミトコンドリア機能を再構成することで天然のミトコンドリアとは異なり生死から切り離すことが可能であり、従来のDDS技術を用いることで細胞への導入が可能となる。そこで膜タンパク質の持つ分子選択性と反応効率を最大限生かして、脱分極に応答して細胞内でエネルギー産生することが可能な人工ミトコンドリアの構築と、ミトコンドリア移植に替わる細胞機能の増強技術の創出に挑戦する。具体的には、内水相を有する微粒子表面に脂質膜を被覆した粒子を作製し、脂質膜被覆微粒子にイオンチャネル、ATP合成酵素を逐次再構成することで、脱分極に応答してエネルギー産生を行うことが可能な人工ミトコンドリアを開発することを目指す。また、人工ミトコンドリアを細胞に導入することで、細胞内でのATP産生能の変化を検証するとともに、細胞機能の増強についてその有効性を検証する。2024年度は、ゼラチンマイクロ粒子の作製を行い、その後網目の大きさが異なるふるいを複数用いて、粒子サイズの異なるゼラチンマイクロ粒子を調製した。また、無細胞膜タンパク質合成を行うために、8つのサブユニットからなるATP合成酵素について、それぞれのユニットを発現するベクターを構築するとともに、イオンチャネルを無細胞膜タンパク質合成するための発現ベクターを構築した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2024年度では、粒子サイズの異なるゼラチンマイクロ粒子の調製を行った。加温下、ゼラチン水溶液をオリーブオイルに滴下し、攪拌することでゼラチンW/Oエマルジョンを作製し、急冷することでゼラチンマイクロ粒子を作製した。その後、網目サイズの異なるふるいを用いて平均3μmのゼラチンマイクロ粒子を回収した。しかしながら、この方法ではゼラチンマイクロ粒子のサイズを厳密に制御することが困難であったことが明らかになったことからも、今後ははマイクロ流体チップを用いて粒子サイズを制御する方法を確立する。
また、脱分極に応答したエネルギー産生を実現するために、それぞれの機能を担う膜タンパク質を無細胞タンパク質合成するためにイオンチャネル、ATP合成酵素を発現するための発現ベクターを9種類構築した。

Strategy for Future Research Activity

2025年度は、加温下のゼラチン水溶液をオリーブオイルにマイクロ流体チップを用いて混合することでW/Oエマルジョンを粒子径が1μm、5μm、20μm程度のGMPをそれぞれ作製することを目指す。W/Oエマルジョンを冷却した後、脱水・熱架橋を施すことで調製する。人工ミトコンドリアに適した粒子サイズが不明であることから脂質二重膜の被覆は、界面通過法にて行う。ハイブリッド粒子の形態的特徴を明らかにするとともに脂質膜の相状態を評価する予定である。無細胞膜タンパク質合成によりハイブリッド粒子表面の脂質膜へイオンチャネル、ATP合成酵素を高密度に集積する技術を確立する予定である。