| Project/Area Number |
24KK0138
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| Research Category |
Fund for the Promotion of Joint International Research (International Collaborative Research)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
塩田 拓也 宮崎大学, フロンティア科学総合研究センター, 准教授 (20819304)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
荒磯 裕平 金沢大学, 保健学系, 准教授 (20753726)
宮崎 亮次 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (30827564)
青木 英莉子 鳥取大学, 工学研究科, 講師 (80822874)
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| Project Period (FY) |
2024-09-09 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥20,800,000 (Direct Cost: ¥16,000,000、Indirect Cost: ¥4,800,000)
Fiscal Year 2026: ¥7,800,000 (Direct Cost: ¥6,000,000、Indirect Cost: ¥1,800,000)
Fiscal Year 2025: ¥6,760,000 (Direct Cost: ¥5,200,000、Indirect Cost: ¥1,560,000)
Fiscal Year 2024: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
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| Keywords | 中性子反射率法 / 高速原子間力顕微鏡 / QCMーD / BAM複合体 / TOM複合体 / タンパク質輸送装置 / グラム陰性菌 |
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| Outline of Research at the Start |
細胞内でのタンパク質の輸送において複数の輸送装置が連携する際に過渡的に接近し、「超」複合体を作ることが知られている。この超複合体は不安定であるため構造解析などが難しく、接近し安定する際の分子機構などについては不明な点が多い。そこで、本研究では不安定なタンパク質の分子形態を解析できる中性子反射率法（Neutron Reflectometry：NR)をその専門家である国際共同研究者のShen博士（オーストラリア、Monash大学）と実施し、超複合体の分子形態を決定する。加えて、国内研究者がAFMや生化学的手法で解析し、超複合体形成の分子機構を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、複数のタンパク質複合体が過渡的に集合して形成される超複合体について、中性子反射率法、水晶マイクロバランス法、高速原子間力顕微鏡などの方法の適用を目指している。初年度は、それぞれの方法に適した超複合体の選定および、各種法のパイロット実験を進めた。大腸菌の外膜のβバレル型膜タンパク質の輸送に関わるBeta-barrel Assembly Machinery (BAM)複合体をモデル輸送装置として解析をすすめている。BAM複合体は、BamAからBamEの5つのサブユニットから形成されているが、そのうちBAM複合体で動的に相互作用する因子であるBamCに関する結合状態を中性子反射率法により測定した。またそのデータを、豪州Shen研究室で解析し、新たな結合状態を見出した。BAM複合体と相互作用するシャペロンSurAの結合状態を架橋実験でとらえ、今後の解析に用いる準備が整った。さらに、BAM複合体によって輸送されるLptDというタンパク質を用いた超複合体解析も進めた。クライオ電子顕微鏡での構造決定や生化学的解析を通して小型外膜リポタンパク質LptMがLptDがLptEとの複合体形成を促進する機構を解明した。
ミトコンドリアの外膜のタンパク質搬入孔Translocase of the outer membrane (TOM)複合体を標的とした解析では、複合体の精製法を改善し、中心的なサブユニットであるが外れやすいTom22が安定的に結合した状態が得られるようになったことを、高速原子間力顕微鏡で確認した。これにより様々な複合体が会合するTom22の受容体部分を確実に存在する状態で解析が進められるようになった。また多様なタンパク質と協働する内膜のプロテアーゼYme1についても精製系を確立し、高速原子間力顕微鏡での構造解析が進められるようになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度は、豪州の共同研究者とともに中性子測定の結果を解析し、BAM複合体の状態を解析することに成功した。またこの解析によりBAM複合体のサブユニットは大きく構造変化し、これまで構造解析で報告されてきた構造とは異なる状態を取ることを見出した。現在、この状態がBAM複合体の機能にどのような役割を担っているかについて解析を進めている。さらにBAM複合体とシャペロンタンパク質の朝複合体解析を進めており、結合部位を決定した。具体的には、BAM複合体のサブユニットの一つであるBamEであることを見出した。これにより次年度以降中性子反射率法によって超複合体解析を行う準備ができている。またTOM複合体についても高精度に高速原子間力顕微鏡によって構造を観察できる状態になっており、次年度以降他の複合体を加えることで、超複合体解析を進める予定である。また、バクテリアの外膜にリポ多糖を輸送する複合体の生合成時に起こる超複合体解析についても構造解析に成功している。
今後、全ての候補長複合体について、海外共同研究先との中性子測定、解析を進める。
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| Strategy for Future Research Activity |
BAM複合体を中心としたモデル超複合体としている塩田、宮崎についてはQCM-DやNRでの解析を進め、オーストラリアに行き国際共同研究者のShen博士と共同で解析を進める。また、TOM複合体をモデルとしている荒磯、塩田は、まずQCM-Dレベルでの解析が可能かどうかオーストラリアにて解析を進める。BAM複合体のBamCの結合部位のダイナミックな変化に関する知見については、生理現象と合わせて論文化を進める。またピロリ菌の解析では、複合体の構成因子の決定とその精製法の確立を目指す。
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