超音波処理によるアミロイド線維形成を指標としたプリオンの新規迅速検出法

• Project/Area Number: 25502004
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Research Field: Reliable environmental measurement methods
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 村山 裕一 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 動物衛生研究部門越境性感染症研究領域, ユニット長 (20192776)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2015: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2014: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2013: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
• Keywords: 異常プリオン蛋白質 / 牛海綿状脳症 / アミロイド線維 / 超音波処理 / チオフラビンT / アミロイド繊維

Outline of Annual Research Achievements

クロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）や牛海綿状脳症（BSE）などのプリオン病の病原体は、高次構造が変化した異常プリオン蛋白質（PrPSc）である。本研究では、超音波処理により、PrPScを核として急速にアミロイド線維が形成される反応を利用し、短時間でかつ高感度にPrPScを検出できる簡便で安全な検出方法を開発する。
26年度は、プリオン蛋白質遺伝子ノックアウトマウス、牛あるいはマウスプリオン蛋白質過発現マウス由来の10%脳乳剤にチオフラビンＴ（ThT, 5μM）を添加し、全自動蛋白質異常凝集インデューサー装置 (Hanabi)を用いて蛍光測定（Ex:445nm, Em:485nm）、超音波処理（15秒照射-1秒休止を5回）、培養（37℃、1時間）の工程を10回繰り返した。また、各脳乳剤を1% Triton Xおよび4 mM EDTAを含むPBSで1:7に希釈したサンプルも同様に解析した。その結果、緩衝液で希釈したプリオン蛋白質過発現マウスの脳乳剤は基質として有効であり、定型BSEおよびL型非定型BSE由来PrPSc（1/1000希釈）の場合、デキストラン硫酸ナトリウム（0.5-1%)を添加することによって、反応開始後２～３時間で急速なThT蛍光の上昇が認められた。
27年度は、ウェル間のばらつきを検証し、反応が良好なウェルを選別した。さらに超音波照射を均一化する目的で、X軸方向にウェルを±8 mm振盪した。ウシリコンビナントプリオン蛋白質（25μg/ml）を1% Triton Xおよび4mM EDTAを含むPBSで希釈し、ThTを加えたものを基質として用いた。またポリアニオンやアルギニンを基質に加え、その効果を検討した。その結果、リコンビナントプリオン蛋白質を基質に用いた場合、L型およびH型非定型BSEプリオンの検出が１～３時間で可能になった。