| Project/Area Number |
25930021
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
基礎医学
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| Research Institution | National Institute for Physiological Sciences |
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Principal Investigator |
前橋 寛 生理学研究所, 技術課, 技術職員
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2014-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2013)
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| Budget Amount *help |
¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000)
Fiscal Year 2013: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000)
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| Keywords | photo-activatable CaMKII / 2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡法 / 蛍光共鳴エネルギー移動測定 |
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| Research Abstract |
研究目的 : 脳神経細胞はネットワークを形成しており、神経細胞上には数千個のシナプスが存在している。もし、その応答を観察することができれば神経細胞ネットワークや細胞活性化の仕組みの解明ができる。そこで、個々のシナプスを時空間的に自在に活性化(長期増強)するための光遺伝学的プローブを開発し、神経細胞が応答する際の必要なシナプスからの入力パターンを明らかにする。
研究方法 : 光(レーザー光)によってミリ秒レベルとマイクロメートルレベルの高時空間分解能でシナプス長期増強を誘発することが可能なCaMKIIシグナル分子(photo-activatable CaMKII, paCaMKII)を遺伝子工学的に開発することにした。CaMKIIは神経細胞の全タンパク質の数パーセントを占め、シナプス長期増強にとって必須のタンパク質である。そこで、CaMKIIに植物由来の光応答性ドメイン(LOV2)を挿入し、さらに様々なリンカー挿入や変異を導入した変異体を作製、2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡法(2-photon fluorescence lifetime imaging microscopy : 2pFLIM)による蛍光共鳴エネルギー移動測定(FRET)によってスクリーニングすることによってpaCaMKIIを作製する。この分子はCaMKIIの制御ドメインとキナーゼの間に青色光により構造変化するLOV2ドメインを遺伝子改変により挿入したものである。また、光照射によって個々のシナプスに長期増強を引き起こすことができるかどうかを神経細胞上のシナプスでpaCaMKIIを2光子励起することで確認した。
研究成果 : この一年で800以上ものDNAコンストラクトを作製し、2pFILMを用いて、スクリーニングした結果、CaMKIIを光照射により活性化し、シナプス部位の体積が増大するのを確認した。paCaMKIIは青色光照射後ミリ秒程度で分子が開状態になりキナーゼ活性が上昇した。
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