アーキアの転写装置を利用した多段階転写反応の動的メカニズムの解明
Publicly Offered Research
| Project Area | Integral understanding of the mechanism of transcription cycle through quantitative, high-resolution approaches |
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| Project/Area Number |
15H01357
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Biological Sciences
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
平田 章 愛媛大学, 理工学研究科(工学系), 講師 (60527381)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2016)
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| Budget Amount *help |
¥11,570,000 (Direct Cost: ¥8,900,000、Indirect Cost: ¥2,670,000)
Fiscal Year 2016: ¥5,720,000 (Direct Cost: ¥4,400,000、Indirect Cost: ¥1,320,000)
Fiscal Year 2015: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000)
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| Keywords | RNAポリメラーゼ / 転写開始前複合体 / アーキア / 転写活性化因子 / X線結晶構造解析 / 電子顕微鏡 / 転写 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、極低温電子顕微鏡による単粒子解析を行うために、アーキアRNAポリメラーゼ（RNAP)とRNAPを含む転写活性化型開始前複合体の調製を行なった。アーキアの基本転写因子TBPとTFB、転写促進因子TFEおよび転写活性化因子Tarの4種類のタンパク質を大腸菌発現系を用いて大量に発現させ、カラムクロマトグラフィーにより精製した。アーキアRNAPは、Thermococcus kodakarensisの培養菌体から抽出・精製した。各タンパク質をTar認識配列およびプロモーター領域を含む二本鎖合成DNAに加え、70℃でインキュベート後、混合溶液をゲル濾過クロマトグラフィーにより、転写活性化型開始前複合体を調製した。アーキアRNAP単独のネガティブステイン解析では、外形構造が電子顕微鏡により明らかになっているが、現在、複合体は解析中である。一方、TarとDNA複合体の共結晶を調製するために、結晶化ロボットを用いて、結晶化条件を検討した。その結果、一塩基突出した二本鎖DNAを用いた場合、Tar-DNA複合体の良質な結晶を得ることに成功し、ある有機溶媒系の沈澱化剤が結晶化に最適であることも分かった。Tar-DNA複合体結晶のX線回折を実験室レベルで確認したところ、2.5 オングストローム分解能であった。今後は、放射光施設で高分解能のTar-DNA複合体のX線結晶構造を決定し、Tarの転写活性化機構を解明する。もう一つの転写活性化因子である原核生物RcdAのDNA認識機構について解明することに成功し、DNA認識に重要なアミノ酸を同定することができた。RcdAの研究成果を国際的な学術雑誌に投稿中である。さらに、計画斑である大阪大学の中村先生らとMD解析により、アーキアRNAPのクランプとストークの連動に二つのサブユニットRpb3とRpb11が重要な構造変化をしていることを見出した。
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| Research Progress Status |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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Report
(2 results)
Research Products
(3 results)
