構造情報に基づいた機能変換による膜孔形成毒素の会合機構の解明

• Project Area: Dynamical ordering of biomolecular systems for creation of integrated functions
• Project/Area Number: 16H00748
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Tohoku University (2017); Hokkaido University (2016)
• Principal Investigator: 田中 良和 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (20374225)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2018-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2017)
• Budget Amount: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2017: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2016: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
• Keywords: 膜孔形成毒素 / タンパク質工学 / 蛋白質 / 微生物 / バイオテクノロジー / タンパク質 / 構造解析 / 生体分子

Outline of Annual Research Achievements

病原性微生物がホスト細胞に障害を与えるために産生する膜孔形成毒素は，可溶性の単量体として分泌されるが，ターゲット細胞に接すると膜上でpreporeと呼ばれる円状の会合体を形成した後，劇的な構造変化を起こして膜孔を形成する．黄色ブドウ球菌は，3種類の非常に類似した膜孔形成毒素（Hla，LukF，Hlg2）を分泌するが，Hlaはホモ7量体の膜孔を形成するのに対し，LukF，Hlg2は交互に会合したヘテロ8量体の膜孔を形成する．毒素同士がどのようにして特定のパートナーとのみ特異的に会合して膜孔を形成するのか，また，7量体・8量体という分子の会合数がどのようにして決定されるのかについては，明らかにできていない．
本研究では，構造解析から提唱された機構を基に変異体蛋白質を合理設計し，毒素の会合特性を改変することを通して，これらの毒素の自己組織化機構を解明することを目指した．立体構造情報をもとに，Hlg2とLukFの接触界面を移植したキメラ変異体を2種類作成した．また，コンピュータシミュレーションにより単量体として機能できるように，界面の残基の変異体を設計した．4種類の変異体を作成した．これらに加え，2成分性毒素の各成分に対し，ステム領域をHlaのもので置換した変異体と，さらにその周辺の重要残基に変異を加えたキメラ変異体を合計16種類作成した．これらのキメラ変異体の溶血活性を種々の条件下で評価した結果，LukFのステム領域はHlaのステム領域で置換可能であることがわかった．また，Hlaのステムで置換したHlg2の種々の変異体のCDスペクトルから，ステム領域の入れ替えにより，単量体の構造に変化が起きていることが示された．また，一連の実験の過程で， Hlg2，LukFのリフォールディングの手法が確立された．

Research Progress Status

平成29年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成29年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] スタンフォード大学(米国)
• [Int'l Joint Research] マックスプランク研究所(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] マックスプランク研究所(ドイツ)
• [Journal Article] Protein encapsulation in the hollow space of hemocyanin crystals containing a covalently conjugated ligand (2019)
  • Author(s): Tsubasa Hashimoto, Yuxin Ye, Mihoko Ui, Tohohisa Ogawa, Takashi Matsui, and Yoshikazu Tanaka
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. Volume: 印刷中 Issue: 1 Pages: 31-36
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2019.04.062
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cryo-EM reveals the asymmetric assembly of squid hemocyanin (2019)
  • Author(s): Tanaka, Y., Kato, S., Stabrin, M., Raunser, S., Matsui, T. & Gatsogiannis, C.
  • Journal Title: International Union of Crystallography (IUCr) Volume: 6 Issue: 3 Pages: 426-437
  • DOI: 10.1107/s205225251900321x
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] SDS-induced oligomerization of Lys49-phospholipase A2 from snake venom (2019)
  • Author(s): Matsui Takashi、Kamata Shizuka、Ishii Kentaro、Maruno Takahiro、Ghanem Nouran、Uchiyama Susumu、Kato Koichi、Suzuki Atsuo、Oda-Ueda Naoko、Ogawa Tomohisa、Tanaka Yoshikazu
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 9 Issue: 1 Pages: 2330-2330
  • DOI: 10.1038/s41598-019-38861-8
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Encapsulation of biomacromolecules by soaking and co-crystallization into porous protein crystals of hemocyanin (2019)
  • Author(s): Tsubasa Hashimoto, Yuxin Ye, Asuka Matsuno, Yuki Ohnishi, Akira Kitamura, Masataka Kinjo, Satoshi Abe, Takafumi Uenod, Min Yao, Tomohisa Ogawa, Takashi Matsuia, Yoshikazu Tanaka
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 509 Issue: 2 Pages: 577-584
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.12.096
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] staphylococcal bi-component toxin for β-barrel pore assembly (2018)
  • Author(s): Kein Takeda, Yoshikazu Tanaka, Naoki Abe, Jun Kaneko
  • Journal Title: Toxicon Volume: 155 Pages: 43-48
  • DOI: 10.1016/j.toxicon.2018.10.002
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Compact seahorse-shaped T cell-activating antibody for cancer therapy (2018)
  • Author(s): Hiroto Fujii, Yoshikazu Tanaka, Hikaru Nakazawa, Aruto Sugiyama, Noriyoshi Manabe, Akira Shinoda, Nobutaka Shimizu, Takamitsu Hattori, Katsuhiro Hosokawa, Takuma Sujino, Tomoyuki Ito, Teppei Niide, Ryutaro Asano, Izumi Kumagai, and Mitsuo Umetsu
  • Journal Title: Advanced Therapeutics Volume: 1700031 Issue: 3 Pages: 1-10
  • DOI: 10.1002/adtp.201700031
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rim domain loops of Staphylococcal β-pore forming bi-component toxin S-components recognize target human erythrocytes in a coordinated manner. (2018)
  • Author(s): Peng Z, Takeshita M, Shibata N, Tada H, Tanaka Y, Kaneko J.
  • Journal Title: J. Biochem. Volume: 印刷中（電子版発行済） Issue: 2 Pages: 93-102
  • DOI: 10.1093/jb/mvy030
  • NAID: 40021635138
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Heme binding to porphobilinogen deaminase from Vibrio cholerae decelerates the formation of 1-hydroxymethylbilane (2018)
  • Author(s): Uchida*, T., Funamizu, T., Chen, M., Tanaka, Y., and Ishimori, K.
  • Journal Title: ACS Chemical Biology Volume: 15 Issue: 3 Pages: 750-760
  • DOI: 10.1021/acschembio.7b00934
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Molluscan hemocyanin: structure, evolution, and physiology (2018)
  • Author(s): Kato Sanae、Matsui Takashi、Gatsogiannis Christos、Tanaka Yoshikazu
  • Journal Title: Biophysical Reviews Volume: 10-2 Issue: 2 Pages: 191-202
  • DOI: 10.1007/s12551-017-0349-4
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structural basis for tRNA-dependent cysteine biosynthesis (2017)
  • Author(s): Chen Meirong、Kato Koji、Kubo Yume、Tanaka Yoshikazu、Liu Yuchen、Long Feng、Whitman William B.、Lill Pascal、Gatsogiannis Christos、Raunser Stefan、Shimizu Nobutaka、Shinoda Akira、Nakamura Akiyoshi、Tanaka Isao、Yao Min
  • Journal Title: Nature Commun. Volume: 8 Issue: 1 Pages: 1521-1521
  • DOI: 10.1038/s41467-017-01543-y
  • NAID: 120006370606
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] pH regulates pore formation of a protease activated Vip3Aa from Bacillus thuringiensis (2017)
  • Author(s): Thittaya Kunthic, Hirokazu Watanabe, Ryuji Kawano, Yoshikazu Tanaka, Boonhiang Promdonkoy, Min Yao, Panadda Boonserm
  • Journal Title: BBA - Biomembranes Volume: 1859 Issue: 11 Pages: 2234-2241
  • DOI: 10.1016/j.bbamem.2017.08.018
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Biochemical and structural characterization of oxygen-sensitive 2-thiouridine synthesis catalyzed by the iron-sulfur protein TtuA (2017)
  • Author(s): Minghao Chen, Shin-ichi Asai, Shun Narai, Shusuke Nambu, Naoki Omura, Yuriko Sakaguchi, Tsutomu Suzuki, Masao Ikeda-Saito, Kimitsuna Watanabe, Min Yao, Naoki Shigi and, Yoshikazu Tanaka
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Volume: 印刷中
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Structural properties of phycoerythrin from dulse palmaria palmata (2017)
  • Author(s): Yoshikatsu Miyabe, Tomoe Furuta, Tomoyuki Takeda, Gaku Kanno, Takeshi Shimizu, Yoshikazu Tanaka, Zuoqi Gai, Hajime Yasui, Hideki Kishimura
  • Journal Title: Journal of Food Biology Volume: 41 Issue: 1 Pages: e12301-e12301
  • DOI: 10.1111/jfbc.12301
  • NAID: 120006382291
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structural basis for recognition of a kink-turn motif by an archaeal homologue of human RNase P protein Rpp38 (2016)
  • Author(s): 179.K. Oshima, Y. Kakiuchi, Y. Tanaka, T. Ueda, T. Nakashima, M. Kimura, and M. Yao
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun Volume: ４７４ Issue: 3 Pages: 541-546
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.04.118
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Crystallographic study of the 2-thioribothymidine-synthetic complex TtuA-TtuB from Thermus thermophilus (2016)
  • Author(s): Chen M, Narai S, Omura N, Shigi N, Chimnaronk S, Tanaka Y, Yao M
  • Journal Title: Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications Volume: F72 Issue: 10 Pages: 777-781
  • DOI: 10.1107/s2053230x16014242
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] 超巨大蛋白質会合体ヘモシアニンのX線結晶構造解析 (2016)
  • Author(s): 松野明日香，田中良和
  • Journal Title: 日本結晶学会誌 Volume: 58 Pages: 91-95
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 蛋白質結晶中の巨大な空隙へのタンパク質の包摂 (2019)
  • Author(s): 橋本翼, 松井崇, 小川智久，田中良和
  • Organizer: PFシンポジウム
• [Presentation] スルメイカ由来ヘモシアニンのクライオ電顕構造とX 線結晶構造の違い (2018)
  • Author(s): 田中良和，松井崇，加藤早苗，Christos Gatsogiannis, Stefan Raunser
  • Organizer: 日本蛋白質科学会
• [Presentation] Molecular Mechanism of Staphylococcal Pore Forming Toxin (2018)
  • Author(s): Yoshikazu TANAKA, Jun KANEKO
  • Organizer: The 79th Okazaki Conference Synthetic, Biological, and Hybrid Molecular Engines
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 巨大蛋白質会合体ヘモシアニンの構造解析 (2018)
  • Author(s): 田中良和
  • Organizer: 日本生物物理学会 東北支部会
• [Presentation] X線結晶構造解析とクライオ電顕、両手法を使って (2018)
  • Author(s): 田中良和
  • Organizer: フォトンファクトリー研究会 X線とクライオ電子顕微鏡で挑む生命の機能とかたち
  • Invited
• [Presentation] Encapsulation of Biomacromolecule into Porous Crystal of a Huge Protein Complex Hemocyanin (2017)
  • Author(s): Koji Kato, Asuka Matsuno, Yuxin Ye, Yuki Ohnishi, Akira Kitamura, Masataka Kinjo, Satoshi Abe, Takashi Ueda, Yoshikazu Tanaka, Min Yao
  • Organizer: 新学術領域研究「動的秩序と機能」第5回国際シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京大学(東京都，目黒区)
  • Year and Date: 2017-01-21
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Pore formation mechanism of staphylococcal pore forming toxin (2016)
  • Author(s): Yoshikazu Tanaka
  • Organizer: Max Planck Institute of Molecular Physiology Department 3 Lab Retreat Seminar
  • Place of Presentation: Ringberg，ドイツ
  • Year and Date: 2016-10-09
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] バクテリアにおけるユビチキン様翻訳後修飾の構造基盤 (2016)
  • Author(s): 陳明皓，奈良井峻，大村直毅，鴫直樹，田中良和，姚閔
  • Organizer: RNAフロンティアミーティング2016
  • Place of Presentation: いこいの湯宿いろは(北海道，虻田郡ニセコ町)
  • Year and Date: 2016-08-31
• [Presentation] バクテリアにおける二機能性ユビキチン様タンパク質の機能調節の構造基盤 (2016)
  • Author(s): 陳明皓，奈良井峻，大村直毅，鴫直樹，田中良和，姚閔
  • Organizer: 第16回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場(福岡県，福岡市)
  • Year and Date: 2016-06-07
• [Presentation] Multidomain architecture of SepCysE confers transsulfursome flexibility to synthesize Cys-tRNACys in two-step indirect pathway (2016)
  • Author(s): Meirong Chen, Yume Kubo, Koji Kato, Yoshikazu Tanaka, Isao Tanaka, Min Yao
  • Organizer: 第53回日本生化学会北海道支部例会 日本生化学会北海道支部・日本生物物理学会北海道支部 合同シンポジウム
  • Place of Presentation: 北海道大学(北海道，札幌市)
• [Patent(Industrial Property Rights)] ヘモシアニン会合体を用いた包摂体の製造方法 (2016)
  • Inventor(s): 田中良和，松野明日香，北村朗，金城政孝，姚閔，上野隆史，安部聡
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人北海道大学，国立大学法人東京工業大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2016-06-01