Directed evolution of peptide ligands under molecular crowding conditions

• Project Area: Chemical Approaches for Miscellaneous / Crowding Live Systems
• Project/Area Number: 18H04535
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Saitama University
• Principal Investigator: 寺井 琢也 埼玉大学, 理工学研究科, 特任准教授 (00508145)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2020-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥5,720,000 (Direct Cost: ¥4,400,000、Indirect Cost: ¥1,320,000); Fiscal Year 2019: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000); Fiscal Year 2018: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
• Keywords: 分子夾雑 / ペプチドアプタマー / 進化分子工学 / 光親和性標識

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、cDNA display 法が持つ分子夾雑環境下での淘汰に対するポテンシャルに着目し、標的分子を夾雑環境下において非固定化条件下で認識するペプチドアプタマーの進化的取得方法の開発を目指している。前年度の研究では、DNAタグを用いてリガンド（＝cDNA display分子）・タンパク質間の結合依存的な光架橋を溶液中で形成させる事が可能であることを、streptavidinをモデル標的タンパク質として示した。本年度はこれに引き続き、別のタンパク質と結合ペプチドの組合せでも同様に光架橋が形成されることを確認した。さらにこの光架橋反応が分子夾雑下でも起こることも確かめ、投稿論文としてオープンアクセス誌Moleculesの分子夾雑特集号に発表した（Molecules, 2020, 25, 1472）。
一方、「cDNA displayを用いた分子夾雑系中での淘汰実験」については、10残基程度の環状ランダムペプチド配列をコードするcDNA displayライブラリを調製し、化学架橋により環化を行った。これを精製した後、標的タンパク質と反応させて親和性のある分子を選択した。セレクションの際はサンプルを2つに分け、通常の緩衝液だけでなく血清を添加した環境でも結合実験を行った。これを何度か繰り返し、「緩衝液セレクション」と「血清セレクション」の夫々に対して次世代シークエンスにより配列解析および上位配列の結合評価を実施したところ、血清を用いたセレクションの方が配列の収束速度や特異性が向上している可能性が示唆された。この事は、当初の作業仮説通り、分子夾雑環境下で試験管内淘汰実験を行う事の有用性およびcDNA display法の優位性を支持していると考えられる。

Research Progress Status

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] In Vitro Construction of Large-scale DNA Libraries from Fragments Containing Random Regions using Deoxyinosine-containing Oligonucleotides and Endonuclease V (2020)
  • Author(s): Yamamoto Yasuhide、Terai Takuya、Kumachi Shigefumi、Nemoto Naoto
  • Journal Title: ACS Combinatorial Science Volume: 22 Issue: 4 Pages: 165-171
  • DOI: 10.1021/acscombsci.9b00167
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Photocrosslinking of cDNA Display Molecules with Their Target Proteins as a New Strategy for Peptide Selection (2020)
  • Author(s): Terai Takuya、Koike Tomoyuki、Nemoto Naoto
  • Journal Title: Molecules Volume: 25 Issue: 6 Pages: 1472-1472
  • DOI: 10.3390/molecules25061472
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] In vitro selection of anti-gliadin single-domain antibodies from a na?ve library for cDNA-display mediated immuno-PCR (2020)
  • Author(s): Jayathilake Chathuni、Kumachi Shigefumi、Arai Hidenao、Motohashi Maiko、Terai Takuya、Murakami Akikazu、Nemoto Naoto
  • Journal Title: Analytical Biochemistry Volume: 589 Pages: 113490-113490
  • DOI: 10.1016/j.ab.2019.113490
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] cDNA Display Mediated Immuno-PCR (cD-IPCR): A Novel PCR-based Antigen Detection Method (2019)
  • Author(s): Jayathilake Chathuni、Terai Takuya、Nemoto Naoto
  • Journal Title: BIO-PROTOCOL Volume: 9 Issue: 24
  • DOI: 10.21769/bioprotoc.3457
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A novel immuno-PCR method using cDNA display (2019)
  • Author(s): Anzai Hiroki、Terai Takuya、Jayathilake Chathuni、Suzuki Takeru、Nemoto Naoto
  • Journal Title: Analytical Biochemistry Volume: - Pages: 1-6
  • DOI: 10.1016/j.ab.2019.04.017
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Selection of peptides that associate with dye-conjugated solid surfaces in a pH-dependent manner using cDNA display (2019)
  • Author(s): Takuya Terai, Hiroki Anzai, and Naoto Nemoto
  • Journal Title: ACS Omega Volume: 4 Issue: 4 Pages: 7378-7384
  • DOI: 10.1021/acsomega.9b00631
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Synthesis of unsymmetrical Si-rhodamine fluorophores and application to a far-red to near-infrared fluorescence probe for hypoxia (2018)
  • Author(s): Hanaoka Kenjiro、Kagami Yu、Piao Wen、Myochin Takuya、Numasawa Koji、Kuriki Yugo、Ikeno Takayuki、Ueno Tasuku、Komatsu Toru、Terai Takuya、Nagano Tetsuo、Urano Yasuteru
  • Journal Title: Chemical Communications Volume: 54 Issue: 50 Pages: 6939-6942
  • DOI: 10.1039/c8cc02451k
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Development of a Series of Practical Fluorescent Chemical Tools To Measure pH Values in Living Samples (2018)
  • Author(s): Takahashi Shodai、Kagami Yu、Hanaoka Kenjiro、Terai Takuya、Komatsu Toru、Ueno Tasuku、Uchiyama Masanobu、Koyama-Honda Ikuko、Mizushima Noboru、Taguchi Tomohiko、Arai Hiroyuki、Nagano Tetsuo、Urano Yasuteru
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society Volume: 印刷中 Issue: 18 Pages: 5925-5933
  • DOI: 10.1021/jacs.8b00277
  • Peer Reviewed
• [Presentation] cDNA display技術を活用した酵素基質ペプチドの網羅探索 (2020)
  • Author(s): 寺井琢也、藤谷聡、根本直人
  • Organizer: 日本化学会 第100春季年会
• [Presentation] 核酸光架橋を利用した新規ペプチドアプタマー探索法の開発 (2020)
  • Author(s): 寺井琢也、小池知幸、根本直人
  • Organizer: 日本薬学会第140年会
• [Presentation] 光架橋塩基を活用した新規ペプチドアプタマー探索法の基盤開発 (2019)
  • Author(s): 小池知幸、寺井琢也、根本直人
  • Organizer: 日本ケミカルバイオロジー学会第14回年会
• [Presentation] 分子夾雑系内淘汰によるIL-17A結合ペプチドの取得 (2019)
  • Author(s): 寺井琢也、安齋宏紀、根本直人
  • Organizer: 日本ケミカルバイオロジー学会第14回年会
• [Presentation] cDNA display法を用いたpH感受性色素結合ペプチドの探索とタンパク質精製への応用 (2019)
  • Author(s): 寺井琢也、安齋宏紀、山田陸、根本直人
  • Organizer: 第13回バイオ関連化学シンポジウム2019
• [Presentation] cDNA display法によるプロテアーゼ基質ペプチドの網羅的スクリーニング (2019)
  • Author(s): 藤谷聡、寺井琢也、根本直人
  • Organizer: 第13回バイオ関連化学シンポジウム2019
• [Presentation] Functionalization of liposomes using artificially evolved peptides against lipid membranes (2019)
  • Author(s): Takuya Terai, Shota Kobayashi, Yuki Yoshikawa, Yasuhito Utsugi, Naoto Nemoto
  • Organizer: CBI学会2019年大会
• [Presentation] cDNA displayの光架橋によるペプチドアプタマー探索の基盤研究 (2019)
  • Author(s): 寺井琢也、小池知幸、根本直人
  • Organizer: 新学術領域「分子夾雑の生命化学」第２回関東地区シンポジウム
• [Presentation] A cDNA display mediated novel immuno-PCR method (2019)
  • Author(s): Chathuni Jayathilate, Hiroki Anzai, Takuya Terai, Naoto Nemoto
  • Organizer: Next Generation Protein Analysis and Detection (3rd ed.)
• [Presentation] cDNA display法を用いた夾雑環境下での試験管内淘汰 (2019)
  • Author(s): 安齋 宏紀、根本 直人、寺井 琢也
  • Organizer: 日本化学会第99春季年会
• [Presentation] In vitro selection of peptide aptamers that recognize a specific conformation of an organic dye (2019)
  • Author(s): 寺井 琢也、安齋 宏紀、山田 陸、根本 直人
  • Organizer: 日本化学会第99春季年会
• [Presentation] 進化分子工学による低分子認識ポリペプチドの開発 (2019)
  • Author(s): 寺井 琢也、安齋 宏紀、山田 陸、根本 直人
  • Organizer: Future Trend in Polymer Science 2018
• [Presentation] pH応答型タンパク質精製システムを目指した低分子結合ペプチドの探索研究 (2018)
  • Author(s): 山田 陸、安齋 宏紀、寺井 琢也、根本 直人
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] cDNA display法を用いたプロテアーゼの基質探査法の開発 (2018)
  • Author(s): 藤谷 聡、寺井 琢也、根本 直人
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] Development of Phenolphthalein Binding Peptide Aptamers Using cDNA Display (2018)
  • Author(s): Hiroki Anzai, Riku Yamada, Takuya Terai, Naoto Nemoto
  • Organizer: 10th International Peptide Symposium
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 埼玉大学工学部応用化学科根本研究室ホームページ
  • URL: http://park.saitama-u.ac.jp/~nemoto/
• [Patent(Industrial Property Rights)] A novel immune-PCR method using cDNA display (2020)
  • Inventor(s): 根本直人、安斎宏紀、鈴木武尊、熊地重文、寺井琢也
  • Industrial Property Rights Holder: 埼玉大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2020
  • Overseas
• [Patent(Industrial Property Rights)] 光架橋塩基を活用した、新規ペプチドアプタマー探索用標的モジュール、新規ペプチドアプタマー探索用リンカー及びそれらを用いる新規ペプチドアプタマーの探索方法 (2020)
  • Inventor(s): 根本直人、寺井琢也
  • Industrial Property Rights Holder: 埼玉大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2020-043550
  • Filing Date: 2020
• [Patent(Industrial Property Rights)] 分子精製用リガンド、分子精製用タグペプチド及びこれらを用いた分子精製方法 (2018)
  • Inventor(s): 根本直人、寺井琢也、安齋宏紀、山田陸
  • Industrial Property Rights Holder: 埼玉大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2018-162831
  • Filing Date: 2018