生体分子の改造・創成を実現する新規進化分子工学的スクリーニング技術の開発

• Project Area: Molecular Engine: Design of Autonomous Functions through Energy Conversion
• Project/Area Number: 19H05380
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 上野 博史 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 助教 (10546592)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000); Fiscal Year 2020: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000); Fiscal Year 2019: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
• Keywords: 分子機械 / 進化分子工学 / マイクロデバイス / ATPase

Outline of Research at the Start

本研究では分子機械の改造・創成を実現する新規進化分子工学的スクリーニング技術の開発を行う。そのため1DNA隔離、タンパク質発現・精製、機能評価、DNA回収という進化分子工学的スクリーニングプロセスの全てをマイクロチャンバーデバイス内で実現する技術を開発する。これまでの研究から精製以外のプロセスのデバイス実装は完了している。そこで本研究では微小ドロップレット内でのタンパク質精製プロセスを組み込んだスクリーニング技術を確立する。さらに確立したスクリーニング技術を分子機械であるF1-ATPaseのスクリーニングへと拡張させ、分子機械の改造や新規機能の創成への適応を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では進化分子工学による生体分子の改造・創成を実現する新規スクリーニング技術の開発を目的とする。具体的には1DNA 隔離、タンパク質発現・精製、機能評価、DNA 回収というスクリーニングプロセスをマイクロチャンバーデバイス内で実現する新規進化分子工学的スクリーニング技術を開発する。本研究が実現すれば、１デバイスあたり数万個～数十万個のライブラリの高精度スクリーニングが一日で可能になる。モデル生体分子としてはATPase を対象とし、ATPを分解して化学エネルギーを力学的エネルギーへと変換する分子機械F1-ATPase の改造や新規機能の創成への適応を目指す。スクリーニングを実現するにはATPase反応のデバイス内での検出が必要になる。そこで前年度に、ATP分解で生じるADP、Piを酵素カップリング反応により蛍光物質へと変換しデバイス内で検出する新規方法を開発し、10分子程度のATPaseの活性を蛍光で検出できることを示した。しかし、サンプルが存在しない場合でも偽陽性の信号が出る問題と、バックグラウンドの蛍光の上昇が大きいという問題が出てきた。そこで本年度は、この計測法の最適化を行った。具体的には、偽陽性信号の原因と考えられた酵素カップリング反応に用いる酵素を全て自前で調製・精製することにより、偽陽性信号の低減を試みた。また溶液の構成要素の検討を行うことで、バックグラウンドの蛍光上昇の低減を試みた。結果、偽陽性信号を1/33に、バックグラウンドの蛍光上昇を1/5に低減することに成功した。さらにこの最適化した実験系により、ATPase１分子のデバイス内検出を実現し、活性の低いATPaseと高いATPaseの活性を区別することにも成功した。これはこの新規検出系を用いることで、活性の高いATPaseをデバイス内でスクリーニング可能であることを示している。

Research Progress Status

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Kinetic analysis of the inhibition mechanism of bovine mitochondrial F1-ATPase inhibitory protein using biochemical assay (2021)
  • Author(s): Kobayashi Ryohei、Mori Sougo、Ueno Hiroshi、Noji Hiroyuki
  • Journal Title: The Journal of Biochemistry Volume: － Issue: 1 Pages: 79-87
  • DOI: 10.1093/jb/mvab022
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The 3 × 120° rotary mechanism ofParacoccus denitrificansF1-ATPase is different from that of the bacterial and mitochondrial F1-ATPases (2020)
  • Author(s): Zarco-Zavala Mariel、Watanabe Ryo、McMillan Duncan G. G.、Suzuki Toshiharu、Ueno Hiroshi、Mendoza-Hoffmann Francisco、Garc?a-Trejo Jos? J.、Noji Hiroyuki
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 117 Issue: 47 Pages: 29647-29657
  • DOI: 10.1073/pnas.2003163117
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Monodisperse Liposomes with Femtoliter Volume Enable Quantitative Digital Bioassays of Membrane Transporters and Cell-Free Gene Expression (2020)
  • Author(s): Soga, N., Ota, A., Nakajima, K., Watanabe, R., Ueno, H., & Noji, H.
  • Journal Title: ACS Nano Volume: 14 Issue: 9 Pages: 11700-11711
  • DOI: 10.1021/acsnano.0c04354
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Correlation between the numbers of rotation steps in the ATPase and proton-conducting domains of F- and V-ATPases (2020)
  • Author(s): Noji Hiroyuki、Ueno Hiroshi、Kobayashi Ryohei
  • Journal Title: Biophysical Reviews Volume: 12 Issue: 2 Pages: 303-307
  • DOI: 10.1007/s12551-020-00668-7
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Tight Chemomechanical Coupling of the F1 Motor Relies on Structural Stability (2020)
  • Author(s): Tanaka Mana、Kawakami Tomohiro、Okaniwa Tomoaki、Nakayama Yohei、Toyabe Shoichi、Ueno Hiroshi、Muneyuki Eiro
  • Journal Title: Biophysical Journal Volume: 119 Issue: 1 Pages: 48-54
  • DOI: 10.1016/j.bpj.2020.04.039
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Tracking the 3D Rotational Dynamics in Nanoscopic Biological Systems. (2020)
  • Author(s): Ryuji Igarashi, Takuma Sugi, Shingo Sotoma, Takuya Genjo, Yuta Kumiya, Erik Walinda, Hiroshi Ueno, Kazuhiro Ikeda, Hitoshi Sumiya, Hidehito Tochio, Yohsuke Yoshinari, Yoshie Harada, Masahiro Shirakawa
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society Volume: 142 Issue: 16 Pages: 7542-7554
  • DOI: 10.1021/jacs.0c01191
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Rotary catalysis of bovine mitochondrial F1-ATPase studied by single-molecule experiments (2020)
  • Author(s): Kobayashi Ryohei、Ueno Hiroshi、Li Chun-Biu、Noji Hiroyuki
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 117 Issue: 3 Pages: 1447-1456
  • DOI: 10.1073/pnas.1909407117
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Wash- and Amplification-Free Digital Immunoassay Based on Single-Particle Motion Analysis (2019)
  • Author(s): Akama Kenji、Iwanaga Niina、Yamawaki Koya、Okuda Masaki、Jain Krupali、Ueno Hiroshi、Soga Naoki、Minagawa Yoshihiro、Noji Hiroyuki
  • Journal Title: ACS Nano Volume: 13 Issue: 11 Pages: 13116-13126
  • DOI: 10.1021/acsnano.9b05917
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Single-molecule analysis reveals rotational substeps and chemo-mechanical coupling scheme of Enterococcus hirae V1-ATPase (2019)
  • Author(s): Iida Tatsuya、Minagawa Yoshihiro、Ueno Hiroshi、Kawai Fumihiro、Murata Takeshi、Iino Ryota
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 294 Issue: 45 Pages: 17017-17030
  • DOI: 10.1074/jbc.ra119.008947
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Mobile imaging platform for digital influenza virus counting (2019)
  • Author(s): Minagawa Yoshihiro、Ueno Hiroshi、Tabata Kazuhito V.、Noji Hiroyuki
  • Journal Title: Lab on a Chip Volume: 19 Issue: 16 Pages: 2678-2687
  • DOI: 10.1039/c9lc00370c
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array (2019)
  • Author(s): Yi Zhang, Yoshihiro Minagawa, Hiroto Kizoe, Kentaro Miyazaki, Ryota Iino, Hiroshi Ueno, Kazuhito V Tabata, Yasuhiro Shimane, Hiroyuki Noji
  • Journal Title: Science Advances Volume: 5 Issue: 8 Pages: 1-11
  • DOI: 10.1126/sciadv.aav8185
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Development of an enzyme-coupled fluorometric digital bioassay for ATPase (2020)
  • Author(s): Hiroshi Ueno, Mayu Hara, Mio Sano, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第58回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Elucidation of inhibition mechanism by IF1, a natural inhibitor protein for bovine mitochondrial ATP synthase (2020)
  • Author(s): Ryohei Kobayashi, Sougo Mori, Hiroshi Ueno, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第58回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Characterization of the enzymatic property and structural dynamics of the T3SS ATPase from Enteropathogenic Escherichia coli (2020)
  • Author(s): Aya Suzuki, Hiroshi Ueno, Ryo Kurosaki, Takayuki Uchihashi, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第58回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Development of a split enzyme for wash-free digital bioassay (2020)
  • Author(s): Yanbo Ma, Hiroshi Ueno, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第58回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Single-molecule analysis of rotation of Enterococcus hirae V-ATPase depending on sodium ion concentration (2020)
  • Author(s): Akihiro Otomo, Tatsuya Iida, Hiroshi Ueno, Takeshi Murata, Ryota Iino
  • Organizer: 第58回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Digital bioassays and digital gene expression for screening (2019)
  • Author(s): Hiroshi Ueno
  • Organizer: The 2nd Conference on Biomotors, Virus Assembly, and Nanobiotechnology Applications
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Gene expression from a single large DNA encapsulated in artificial cell device (2019)
  • Author(s): Yuto Ochiai, Hiroshi Ueno, Masayuki Su'etsugu, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第57回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Rotation observation of hybrid F1-ATPases between bacterial and mammalian ones (2019)
  • Author(s): Ryo Watanabe, Hiroshi Ueno, Toshiharu Suzuki, Ryohei Kobayashi, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第57回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Single-molecule analysis of bovine mitochondrial F1-ATPase (2019)
  • Author(s): Ryohei Kobayashi, Hiroshi Ueno, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第57回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Analysis of the inhibited form of F1-ATPase (2019)
  • Author(s): Sougo Mori, Hiroshi Ueno, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第57回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Chemo-mechanical coupling scheme of rotary molecular motor Enterococcus hirae V1-ATPase revealed by single-molecule analysis (2019)
  • Author(s): Tatsuya Iida, Yoshihiro Minagawa, Hiroshi Ueno, Fumihiro Kawai, Takeshi Murata, Ryota Iino
  • Organizer: 第57回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Relationship between fluctuation of single-enzyme activity and evolvability (2019)
  • Author(s): Hiroshi Ueno, Morito Sakuma, Yoshihiro Minagawa, Kazuhito Tabata, Kentaro Miyazaki, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第57回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Reconstruction and Characterization of Ancestral F1-ATPase (2019)
  • Author(s): Nanako Nakama, Hiroshi Ueno, Ryutaro Furukawa, Ryohei Kobayashi, Ryo Watanabe, Satoshi Akanuma, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第57回日本生物物理学会年会