Crowding and confinement effects on protein dynamics and function

• Project Area: Chemical Approaches for Miscellaneous / Crowding Live Systems
• Project/Area Number: 20H04708
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 中曽根 祐介 京都大学, 理学研究科, 助教 (00613019)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000); Fiscal Year 2021: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000); Fiscal Year 2020: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
• Keywords: クラウディング / 反応ダイナミクス / 揺らぎ / 過渡回折格子法 / 細胞抽出液 / 閉じ込め効果 / 混み合い効果 / 相分離 / 微小空間 / 光センサー

Outline of Research at the Start

タンパク質の動的挙動に対する閉じ込め効果および混み合い効果の解明を目的とする。そのために様々な微小空間内において、タンパク質の揺らぎや反応を、過渡回折格子（TG）法により時間分解で調べる。さらに分子の局在化や酵素活性についても定量的に調べ、閉じ込め効果の要因や、混み合い効果との相乗（相殺）効果、生理機能への影響を物理化学の言葉で明らかにする。こうして夾雑環境の本質的な理解のみならず、「非線形な混み合い効果」や「閉じ込め効果と混み合い効果の協奏」を明らかにし、生命機能を支える複雑かつ絶妙なバランスの解明を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

細胞環境を生体分子の反応場として理解するために、様々なクラウディング環境下で、光センサータンパク質PACの反応・揺らぎ・安定性・酵素活性を調べた。主に過渡回折格子（TG）法を用いた解析により、構造安定性と構造揺らぎにトレードオフの関係があることや、光反応性および酵素活性がクラウディング剤濃度の増加とともに単調に低下することを明らかにした。その主な要因として溶液の粘度上昇や排除体積効果が挙げられるが、反応性や機能が低下するという結果は、タンパク質が細胞環境に最適化されているという当初の予想に反するものであった。
細胞内はタンパク質・核酸・代謝物など多様な分子が複雑に共存する環境であり、種々の効果の調和によりタンパク質の動態が決まると考えられる。つまり少数の要素を高濃度に加えるのみでは、これらの調和を解明することは困難である。そこでツメガエルの未受精卵を集め、超遠心分離によって細胞質および核質を希釈すること無しに分画した（九州大学・高橋達郎博士との共同研究）。この卵抽出液は、DNAの合成や修復など、卵細胞が本来持つ生理的活性を試験管内で示すため、細胞内環境を再現する系として理想的である。TG法や蛍光観測により、卵抽出液中でのPACの反応・活性解析を行った結果、少数の要素を高濃度に加えた人工混雑環境とは大きく異なる挙動が観測された。特に酵素活性が回復した点が興味深く、その分子機構に関する解析を進めた。
また細胞内は共局在化や液－液相分離など不均一環境の宝庫であり、生体分子の動的挙動も局所環境の変化に応じて時空間的に変化すると予想される。こうしたダイナミックな世界を実測するために、対物レンズを用いたTG法の開発に取り組んだ。これまでに細胞サイズ程度の微小空間における反応解析が可能な系を構築しており、今後は人工的な微小夾雑空間における分子ダイナミクス解析を進める予定である。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Selective Photoinduced Dimerization and Slow Recovery of a BLUF Domain of EB1 (2022)
  • Author(s): Shibata Kosei、Nakasone Yusuke、Terazima Masahide
  • Journal Title: The Journal of Physical Chemistry B Volume: 126 Issue: 5 Pages: 1024-1033
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.1c10100
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Slow Conformational Changes of Blue Light Sensor BLUF Proteins in Milliseconds (2022)
  • Author(s): Tokonami Shunrou、Onose Morihiko、Nakasone Yusuke、Terazima Masahide
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society Volume: 144 Issue: 9 Pages: 4080-4090
  • DOI: 10.1021/jacs.1c13121
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Time-resolved diffusion reveals photoreactions of BLUF proteins with similar functional domains (2022)
  • Author(s): Nakasone Yusuke、Terazima Masahide
  • Journal Title: Photochemical & Photobiological Sciences Volume: - Issue: 4 Pages: 493-507
  • DOI: 10.1007/s43630-022-00214-2
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Enzymatic activity of the blue light‐regulated phosphodiesterase BlrP1 from Klebsiella pneumoniae shows a nonlinear dependence on light intensity (2021)
  • Author(s): Shibata Kosei、Nakasone Yusuke、Terazima Masahide
  • Journal Title: FEBS Letters Volume: - Issue: 10 Pages: 1473-1479
  • DOI: 10.1002/1873-3468.14073
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Photoreaction of photoactivated adenylate cyclase from cyanobacterium Microcoleus chthonoplastes (2021)
  • Author(s): Ikoma Misato、Nakasone Yusuke、Terazima Masahide
  • Journal Title: Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology Volume: 221 Pages: 112252-112261
  • DOI: 10.1016/j.jphotobiol.2021.112252
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Time-Resolved Diffusion Technique for Detection of the Conformational Changes and Molecular Assembly/Disassembly Processes of Biomolecules (2021)
  • Author(s): Nakasone Yusuke、Terazima Masahide
  • Journal Title: Frontiers in Genetics Volume: 12 Pages: 1-14
  • DOI: 10.3389/fgene.2021.691010
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Effect of Hydrated Ionic Liquid on Photocycle and Dynamics of Photoactive Yellow Protein (2021)
  • Author(s): Umezaki Utana、Hatakenaka Miu、Onodera Kana、Mizutani Hiroto、Kim Suhyang、Nakasone Yusuke、Terazima Masahide、Kimura Yoshifumi
  • Journal Title: Molecules Volume: 26 Issue: 15 Pages: 4554-4554
  • DOI: 10.3390/molecules26154554
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A unique photochromic UV-A sensor protein, Rc-PYP, interacting with the PYP-binding protein (2021)
  • Author(s): Kim Suhyang、Nakasone Yusuke、Takakado Akira、Yamazaki Yoichi、Kamikubo Hironari、Terazima Masahide
  • Journal Title: Physical Chemistry Chemical Physics Volume: 23 Issue: 33 Pages: 17813-17825
  • DOI: 10.1039/d1cp02731j
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Time-resolved detection of SDS-induced conformational changes in α-synuclein by a micro-stopped-flow system (2021)
  • Author(s): Takaramoto Shunki、Nakasone Yusuke、Sadakane Kei、Maruta Shinsaku、Terazima Masahide
  • Journal Title: RSC Advances Volume: 11 Issue: 2 Pages: 1086-1097
  • DOI: 10.1039/d0ra09614h
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Photoreaction Dynamics of a Full-Length Protein YtvA and Intermolecular Interaction with RsbRA (2020)
  • Author(s): Choi Seokwoo、Nakasone Yusuke、Hellingwerf Klaas J.、Terazima Masahide
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 59 Issue: 50 Pages: 4703-4710
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.0c00888
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Wavelength-Dependent Photoreaction of PYP from Rhodobacter capsulatus (2020)
  • Author(s): Kim Suhyang、Nakasone Yusuke、Takakado Akira、Yamazaki Yoichi、Kamikubo Hironari、Terazima Masahide
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 59 Issue: 51 Pages: 4810-4821
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.0c00821
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 光誘起フォールディング反応および分子シャペロンSecBとの相互作用ダイナミクス (2022)
  • Author(s): 中曽根祐介
  • Organizer: 日本化学会第102春季年会
• [Presentation] 光応答性DNAとT7 RNAポリメラーゼの分子間相互作用ダイナミクス (2021)
  • Author(s): 中曽根祐介
  • Organizer: 第15回分子科学討論会
• [Presentation] 夾雑微小空間におけるタンパク質の動的挙動 (2020)
  • Author(s): 中曽根祐介
  • Organizer: 分子夾雑の生命化学 第４回領域会議
• [Book] 相分離生物学の全貌（現代化学増刊46) (2020)
  • Author(s): 白木 賢太郎（共著）
  • Total Pages: 400
  • Publisher: 東京化学同人
  • ISBN: 9784807913466