機能不全リボソームRNAを選択的に認識する因子の同定

• Project Area: Diversity and asymmetry achieved by RNA program
• Project/Area Number: 21112511
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 北畠 真 京都大学, ウイルス研究所, 助教 (10321754)
• Project Period (FY): 2009 – 2010
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2010)
• Budget Amount: ¥9,490,000 (Direct Cost: ¥7,300,000、Indirect Cost: ¥2,190,000); Fiscal Year 2010: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2009: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
• Keywords: 品質管理 / リボソーム / RNA

Research Abstract

本研究課題では、出芽酵母において観察される「機能不全リボソームの選択的分解による品質管理」に着目し、どのような仕組みで数多くのリボソームの中から機能不全の分子だけを見分けることができるのか、細胞がとっている戦略を分子のレベルで理解することを目的に研究を行った。これまでにわれわれの研究から、機能不全リボソームがMms1/Rtt101という2つの因子に依存して選択的にユビキチン化を受けることが明らかになっていたが、本課題では生化学的な方法を用いて機能不全リボソームを精製し、解析するという手段を用いた。具体的には機能不全リボソームの25S rRNA上にMS2結合配列を繰り返し挿入し、MS2コートタンパクと融合したGSTたんぱく質を用いてリボソームをプルダウンするという新しい実験系を開発した。MS2タグ配列を持った25S rRNAの活性中心(PTC)に、機能を失わせるための点変異を導入することで、細胞の中から特定の変異25S rRNAのみを含む機能不全リボソームを回収することに成功した。MS2タグ配列を挿入したことが、リボソームの機能に影響を与えないこと、またこの配列が機能不全リボソームのMms1依存的なユビキチン化を阻害しないこともあわせて確認してある。このようにして得られた機能不全リボソームを詳細に解析することで、いくつかの新しい知見が明らかになった。まず第一に、本研究で扱っているPTCに変異を持つ機能不全リボソームが、A-siteに開始Met tRNAを持つことと、P-siteにさまざまなtRNAを一分子持つことが示唆された。このことは、ユビキチン化の標的になるリボソームは開始コドン上で80Sを形成し、しかも2つのtRNA結合部位の両方にtRNAを含んだ形で停止した分子であろうということを示す。さらに、機能不全リボソームに含まれるたんぱく質の質量分析による解析から、ユビキチン化の標的が明らかになり、機能不全リボソームの特異的認識がどのようになされるかについてのモデルが立てられる段階に研究が進展してきている。

Research Products

• [Journal Article] Site-specific incorporation of 4-iodo-l-phenylalanine through opal suppression (2010)
  • Author(s): Kodama K, Nakayama H, Sakamoto K, Fukuzawa S, Kigawa T, Yabuki T, Kitabatake M, Takio K, Yokoyama S.
  • Journal Title: J.Biochem Volume: 148 Pages: 179-187
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 真核生物リボソームの生合成と品質管理 (2010)
  • Author(s): 北畠真、藤井耕太郎、大野睦人
  • Journal Title: 実験医学 増刊「拡大・進展を続けるRNA研究の最先端」 Pages: 150-155
• [Journal Article] A role for ubiquitin in the clearance of nonfunctional rRNAs (2009)
  • Author(s): 藤井耕太郎・北畠真・坂田知子・宮田淳美・大野睦人
  • Journal Title: Genes and Development 23 Pages: 963-974
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] リボソームRNAの品質管理 (2009)
  • Author(s): 北畠真・藤井耕太郎・大野睦人
  • Journal Title: 蛋白質核酸酵素 増刊 54 Pages: 2195-2200
• [Presentation] 真核生物における機能不全リボソームの選択的分解 (2010)
  • Author(s): 北畠真、藤井耕太郎、酒井朗恵、坂田知子、大野睦人
  • Organizer: 日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2010-12-07
• [Presentation] リボソームRNAの品質管理におけるユビキチンの役割～DNA修復との接点 (2010)
  • Author(s): 北畠真、藤井耕太郎、坂田知子、酒井朗恵、大野睦人
  • Organizer: 第39回日本環境変異原学会年会
  • Place of Presentation: つくば
  • Year and Date: 2010-11-17
• [Presentation] 機能不全リボソームが分解される仕組み (2010)
  • Author(s): 北畠真、藤井耕太郎、酒井朗恵、大野睦人
  • Organizer: 日本RNA 学会年会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2010-07-28
• [Presentation] Selective degradation of nonfunctional ribosomal RNAs mediated by the ubiquitin-proteasome system (2010)
  • Author(s): Kitabatake M, Fujii K, Sakata T, Miyata M, Ohno M.
  • Organizer: The 19th CDB Meeting "RNA Sciences in Cell and Developmental Biology"
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2010-05-11
• [Presentation] リボソームRNAの品質管理におけるユビキチンの新たな役割 (2009)
  • Author(s): 北畠真
  • Organizer: 第82回日本生化学会年会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場
  • Year and Date: 2009-10-22
• [Presentation] A role for ubiquitin in the clearance of nonfunctional rRNAs (2009)
  • Author(s): 北畠真
  • Organizer: 8th International Conference on Ribosome Synthesis
  • Place of Presentation: Regensburg, Germany
  • Year and Date: 2009-08-28
• [Presentation] A role for ubiquitin in the clearance of nonfunctional rRNAs (2009)
  • Author(s): 北畠真
  • Organizer: RNA meeting2009
  • Place of Presentation: Madison (WI), USA
  • Year and Date: 2009-05-28