ゼブラフィッシュの覚醒・睡眠の分子機構に関する研究

• Project Area: Systems molecular ethology to understand the operating principle of the nervous system
• Project/Area Number: 21115504
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Saitama University
• Principal Investigator: 中井 淳一 埼玉大学, 脳科学融合研究センター, 教授 (80237198)
• Project Period (FY): 2009 – 2010
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2010)
• Budget Amount: ¥7,280,000 (Direct Cost: ¥5,600,000、Indirect Cost: ¥1,680,000); Fiscal Year 2010: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000); Fiscal Year 2009: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
• Keywords: 脳・神経 / 行動 / 生理学 / 神経科学 / 睡眠 / 覚醒 / ゼブラフィッシュ / カルシウム

Research Abstract

多くの動物は眠るが、睡眠の分子メカニズムはまだ良くわかっていない。この状況は、Hypocretin/Orexin(Hcrt)とその受容体が発見され大きく進展した。本研究は、ゼブラフィッシュを用いて動物の睡眠と覚醒の分子機構を明らかにすることを目的としている。そこで蛍光カルシウムプローブG-CaMPを神経細胞に発現させ神経細胞の機能とゼブラフィッシュの行動との関係を探ることを計画した。本研究において蛍光カルシウムプローブG-CaMP2を改良したG-CaMP-HSを新たに開発した。G-CaMP-HSはG-CaMP2と比較して高感度であるとともに、細胞内でのタンパク質の安定性が増しており、安静時の蛍光強度が高いという特徴を持つ。これに関連して、蛍光カルシウムプローブの性能向上に関する特許を申請した。次にG-CaMP-HSをGal4-UASの下流につないだコンストラクトを作成し、ゼブラフィッシュに導入することにより遺伝子改変ゼブラフィッシュを作成した。このゼブラフィッシュと運動ニューロン(Caudal primary neuron : CaPニューロン)にGal4を発現するゼブラフィッシュ(SAIGFF213A)とを掛け合わせることによりCaPニューロンにG-CaMP-HSを発現するゼブラフィッシュを作成した。CaPニューロンの活動をイメージングにより解析したところ、CaPニューロンのバースト発火に伴い、G-CaMP-HSの蛍光強度が変化することが観察された。この成果はProc Natl Acad Sci USAに報告した。ゼブラフィッシュの神経細胞からG-CaMP-HSを用いて神経活動をイメージングにて解析することが可能となったことにより、今後HcrtニューロンにG-CaMP-HSを発現させ解析することにより睡眠覚醒のメカニズムの解明が進むと考えられる。

Research Products

• [Journal Article] Genetic visualization with an improved GCaMP reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish (2011)
  • Author(s): Muto A, Ohkura M, Kotani T, Higashijima S-I, Nakai J, Kawakami K
  • Journal Title: Proc Natl Acad Sci USA Volume: 108 Pages: 5425-5430
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Derived (mutated)-types of TRPV6 channels elicit greater Ca^<2+> influx into the cells than ancestral-types of TRPV6 : Evidence from Xenopus oocytes and mammalian cell expression system (2010)
  • Author(s): Sudo Y, Matsuo K, Tetsuo T, Tsutsumi S, Ohkura M, Nakai J, Uezono Y
  • Journal Title: J Pharmacol Sci Volume: 114 Pages: 281-291
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Tissue-tissue interaction-triggered calcium elevation is required for cell polarization during Xenopus gastrulation (2010)
  • Author(s): Shindo, A., Hara, Y., Yamamoto, T.S., Ohkura, M., Nakai, J., Ueno, N.
  • Journal Title: PLoS One 5
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 新しい蛍光Ca^<2+>イセンサーG-CaMPを用いた生体Ca^<2+>画像化 (2010)
  • Author(s): 大倉正道, 中井淳一
  • Journal Title: 生体の科学 61 Pages: 86-92
• [Presentation] GCaMP型改良カルシウムプローブ蛋白質を用いたXenopus胚発生時のカルシウム動態の可視化 (2011)
  • Author(s): 大倉正道, 進藤麻子, 原佑介, 山本隆正, 上野直人, 中井淳一
  • Organizer: 第84回日本薬理学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川)
  • Year and Date: 2011-03-24
• [Presentation] G-CaMPを用いた線虫体壁筋のin vivoカルシウムイメージング (2011)
  • Author(s): 中井淳一, 安藤恵子, 宇佐美篤, 大倉正道, 池谷裕二, 松木則夫
  • Organizer: 第84回日本薬理学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川)
  • Year and Date: 2011-03-24
• [Presentation] In vivo Imaging with Genetically-encoded Ca^<2+> Sensors (2010)
  • Author(s): Nakai J
  • Organizer: Horizons In Calcium Signaling
  • Place of Presentation: Beijing, China
  • Year and Date: 2010-10-12
• [Presentation] 新規蛍光Ca^<2+>センサーG-CaMP4を用いた生体Ca^<2+>の画像化 (2010)
  • Author(s): 宇佐美篤, 安藤恵子, 大倉正道, 池谷裕二, 中井淳一, 松木則夫
  • Organizer: 次世代を担う創薬・医療薬理シンポジウム2010
  • Place of Presentation: 京都大学(京都)
  • Year and Date: 2010-09-11
• [Presentation] G-CaMPによるin vivo calcium imaging (2010)
  • Author(s): 中井淳一
  • Organizer: 平成22年度生理学研究所研究会「神経活動の光操作(行動制御への応用)」
  • Place of Presentation: 生理学研究所(愛知)
  • Year and Date: 2010-09-09
• [Presentation] Brain Imaging with Improved GCaMPs in Zebrafish (2010)
  • Author(s): Muto A, Nakai J, Kawakami K
  • Organizer: Neuro 2010
  • Place of Presentation: 神戸コンベンションセンター(兵庫)
  • Year and Date: 2010-09-03
• [Presentation] In vivo or in vitro imaging of calcium dynamics with genetically encoded sensor G-CaMP4 (2010)
  • Author(s): Usami A, Gengyo-Ando K, Ohkura M, Matsuki N, Ikegaya Y, Nakai J
  • Organizer: Neuro 2010
  • Place of Presentation: 神戸コンベンションセンター(兵庫)
  • Year and Date: 2010-09-03
• [Presentation] GFPを用いたカルシウムセンサーによる細胞活動の可視化 (2010)
  • Author(s): 中井淳一
  • Organizer: 病態解明から治療開発に向けたバイオイメージング研究シンポジウム
  • Place of Presentation: 自治医科大学(栃木)
  • Year and Date: 2010-06-04
• [Presentation] 小脳バーグマングリア細胞間を伝わるカルシウム波 (2010)
  • Author(s): 中井淳一
  • Organizer: 第7回GPCR研究会
  • Place of Presentation: 科学未来館(東京)
  • Year and Date: 2010-05-08
• [Presentation] 小脳グリア細胞間のカルシウム波の in vivo 解析 (2010)
  • Author(s): Nakai, J., Hoogland, T.M., Kuhn, B., Gobel, W., Huang, W., Helmchen, F., Flint, H., Wang, S.S.-H.
  • Organizer: 日本薬理学会
  • Place of Presentation: 大阪国大会議場
  • Year and Date: 2010-03-16
• [Patent(Industrial Property Rights)] 特定部位のアミノ酸を置換した緑色蛍光蛋白質またはそのホモログを用いたカルシウムセンサー蛋白質 (2010)
  • Inventor(s): 大倉正道, 中井淳一
  • Industrial Property Rights Holder: 埼玉大学
  • Industrial Property Number: 2010-232788
  • Filing Date: 2010-10-15