逆行性バーコーディングによる局所神経回路構造の解明
Publicly Offered Research
| Project Area | Census-based biomechanism of circuit construction and transition for adaptive brain functions |
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| Project/Area Number |
22H05495
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Transformative Research Areas, Section (III)
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
濱口 航介 京都大学, 医学研究科, 講師 (50415270)
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| Project Period (FY) |
2022-06-16 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥9,880,000 (Direct Cost: ¥7,600,000、Indirect Cost: ¥2,280,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
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| Keywords | バーコード / 逆行性ウィルス / ２光子カルシウムイメージング / 透明化 / 局所回路 / FISH / 拡大透明化 / 空間トランスクリプトミクス / バーコード化 / 狂犬病ウィルス / カルシウムイメージング / 短期記憶 |
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| Outline of Research at the Start |
神経細胞は多様なサブタイプを持ち，それぞれが独自の神経回路接続を持つ．RNA-seqや 蛍光 in-situ hybridization (FISH) は細胞の持つ遺伝子発現パターンを調べる事ができる強力な手法であるが，接続情報を取り込む事ができない．本研究で開発する逆行性バーコーディングは，バーコード付き狂犬病ウィルスを用いて細胞同士の接続情報をRNA-seq や FISHに付け加える重要な技術である．本研究では，逆行性バーコーディングと改良されたFISHを用いて，前頭皮質の局所回路構造と関連する遺伝子発現パターンを明らかにする．
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経細胞は多様なサブタイプを持ち、それぞれが独自の神経回路接続を持つ。RNA-seqや 蛍光 in-situ hybridization (FISH) は細胞の持つ遺伝子発現パターンを調べる事ができる強力な手法であるが、接続情報を取り込む事ができない。本研究で開発する逆行性バーコーディングは、バーコード付き狂犬病ウィルスを用いて細胞同士の接続情報をRNA-seq や FISHに付け加える重要な技術である。本研では、逆行性バーコーディングと改良されたFISHを用いて、短期記憶に関わる前頭皮質の局所回路構造を解明する事を目指す。
初年度では、技術的課題のいくつかを解決した。１）まず in-vivoで観察された２光子観察断面を、ex-vivo で同定するためには、ある程度の厚みのある切片を作成する必要がある。しかし厚みのある切片では、蛍光in-situ hybridization（FISH）によるRNAの検出が難しい。そこで拡大透明化の方法を用いる事で、300μm厚の切片から複数回のFISHを行う方法を確立した。２）逆行性感染を起こす狂犬病ウィルスにバーコード配列をつけても、脳内で増殖し逆行性に前シナプス細胞に感染できるか、実際にウィルスを作成し、感染および逆行性の伝播を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
解決すべき技術的課題が、初年度でおおむね解決できた。そのため、次年度での大規模な実験に向けての準備が整った。
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| Strategy for Future Research Activity |
理論的な課題としては、複数回のFISHの画像の位置合わせ。実験的な課題としては、バーコード配列の組み合わせ増大の２点が今後の課題である。これを次年度で確実に解決し、局所回路の解明に進みたい。
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Report
(1 results)
Research Products
(3 results)
