個体・組織での１細胞機能イメージングを可能にする光活性化機能センサータンパク質

• Project Area: Cross-talk between moving cells and microenvironment as a basis of emerging order in multicellular systems
• Project/Area Number: 23111502
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 松田 知己 大阪大学, 産業科学研究所, 助教 (50419206)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2013-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥9,230,000 (Direct Cost: ¥7,100,000、Indirect Cost: ¥2,130,000); Fiscal Year 2012: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2011: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
• Keywords: ライブセルイメージング / 蛍光タンパク質 / バイオセンサー / 蛍光顕微鏡 / 光操作

Outline of Annual Research Achievements

申請者はこれまでにFRET（蛍光エネルギー移動）を利用したカルシウムイオン濃度センサータンパク質Cameleon YC3.6 を元に光活性化カルシウムイオン濃度センサータンパク質 PA-Cameleon を作製していた。このセンサータンパク質はFRETのエネルギーのドナーであるPA-GFP（光活性化GFP）、エネルギーのアクセプターである色素タンパク質、そしてセンサードメインとしてのカルシウム結合タンパク質Calmodulin-M13 ペプチドから構成されていた。PA-Cameleon は HeLa 細胞内でのカルシウム応答の可視化に成功していたが、神経細胞内で自発的なカルシウム濃度変化等を検知することが出来なかった。そこで、センサー部分をニワトリ骨格筋由来トロポニンCに入れ替えて新たにPA-TNXL を開発し、ラット海馬神経の初代培養細胞内で１細胞レベルの光活性化、細胞内の自発的なカルシウム振動を可視化することに成功した (Matsuda T. et. al. Sci. Rep. 2013)。
さらに、FRETとは異なる原理で光活性化カルシウムイオン濃度センサーを開発した。光刺激によって蛍光波長を変化させることができる蛍光タンパク質 mMaple に円順列変異を導入し、蛍光発色団付近に新たに出来たN末端、C末端にそれぞれM13とカルモジュリンを繋げたコンストラクトを基に、遺伝子改変により新規カルシウムイオンセンサータンパク質 GR-GECO を開発した。GR-GECOは光刺激により緑色から赤色に蛍光色を変化させ、カルシウム濃度上昇に伴い蛍光強度の増大させることができる。本センサーについてもHeLa細胞内とラット海馬神経細胞での光活性化とカルシウムイメージングに成功した (Hoi H., Matusda T. et. al. J. Am. Chem. Soc. 2013)。

Research Progress Status

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Highlighted Ca2+ imaging with a genetically encoded ‘caged’ indicator (2013)
  • Author(s): Matsuda T, Horikawa K, Saito K, Nagai T.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 3:1398 Issue: 1 Pages: 1-4
  • DOI: 10.1038/srep01398
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Improved orange and red Ca2+ indicators and photophysical considerations for optogenetic applications (2013)
  • Author(s): Wu J, Liu L, Matsuda T, Zhao Y, Rebane A, Drobizhev M, Chang Y-F, Araki S, Arai Y, March K, Thomas H, Sagou K, Miyata T, Nagai T, Li W, Campbell R.
  • Journal Title: ACS Chem Neurosci. Volume: 印刷中
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Highlightable Ca2+ Indicators for Live Cell Imaging (2012)
  • Author(s): Hoi H, Matsuda T, Nagai T, Campbell RE.
  • Journal Title: J Am Chem Soc. Volume: 135 Issue: 1 Pages: 46-49
  • DOI: 10.1021/ja310184a
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Imaging the dynamics of intracellular protein translocation by photoconversion of phamret-cybr/ROM (2011)
  • Author(s): Yang L.
  • Journal Title: Journal of Microscopy Volume: VOL. 242 Pages: 250-261
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Development of the Photoactivatable Ca2+ Indicator to Visualize Biological Events in Single Arbitrary Cells (2013)
  • Author(s): 松田 知己
  • Organizer: the 23rd CDB Meeting
  • Place of Presentation: Riken CDB 、神戸市
• [Presentation] A genetically encoded photoactivatable Ca2+ indicator to visualize Ca2+ dynamics in single arbitrary cells (2012)
  • Author(s): 松田 知己
  • Organizer: 12th ECS Meeting
  • Place of Presentation: Toulouse, France
• [Presentation] Genetically-endoded photoactivatable functional indicator (2012)
  • Author(s): 松田 知己
  • Organizer: 第4回光操作研究会
  • Place of Presentation: 自然科学研究機構 岡崎カンファレンスセンター、岡崎市
  • Invited
• [Presentation] Development of the Photoactivatable Calcium Ion Sensor to Visualize Biological Events in Single Arbitrary Cells within Tissue (2012)
  • Author(s): 松田 知己
  • Organizer: 第35回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場、福岡市
• [Presentation] Photoactivatable Ca^<2+> Indicator to Visualize Biological Events in Single Arbitrary Cells Within Tissues / Whole Body (2011)
  • Author(s): Tomoki Matsuda
  • Organizer: Gordon Research Conference, Calcium Signalling
  • Place of Presentation: Colby College (USA)
  • Year and Date: 2011-06-30