マクロファージの異常な活性化に起因する慢性炎症発症機序の解明

• Project Area: Mutli-dimensional fluorescence live imaging of cellular function and molecular activity
• Project/Area Number: 25113716
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 堀川 一樹 徳島大学, 大学院ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (70420247)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥10,660,000 (Direct Cost: ¥8,200,000、Indirect Cost: ¥2,460,000); Fiscal Year 2014: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000); Fiscal Year 2013: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: イメージング / マクロファージ / 炎症

Outline of Annual Research Achievements

マクロファージの炎症応答を可視化する事を目的に、インフラマソームを介したcaspase-1プロテアーゼ活性をモニターできるFRET型指示薬を開発した。分子設計として、caspase-1が認識・切断するタンデムペプチドモチーフの両端に蛍光タンパク質ECFPならびにcp173Venusを有するFRET解消型指示薬を構築した。試験管内アッセイで十分な応答を示す事を確認した後、細胞内アッセイを実施した。細胞質分布型の指示薬をレンチウイルスを用いて単球系細胞株THP1細胞に導入し、様々な刺激に伴うcaspase-1活性を計測した。その結果、ATP添加によるプリン受容体刺激、シリカビーズもしくは細菌の貪食のいずれにおいても、細胞質分布型の指示薬のFRETシグナルが解消されることを単一細胞レベルで確認した。シグナル変化はall-or-nonタイプで、その時間スケールは応答の開始から10分以内に完了するなど、細胞死を制御する他のcaspaseファミリーの活性化に比べ急峻な反応であること、刺激応答のタイミングは細胞毎に異なり、刺激の強度に応じ待ち時間積算型の分布を示すこと、が明らかになった。なお、caspase-1の活性化に伴い、細胞膜の透過性が急激に上昇し指示薬を含む細胞内容物が放出されるため、刺激応答した死細胞を同定することができないという問題が明らかになった。そこで刺激応答後の細胞も検出できるよう指示薬を細胞内に滞留させる方法を検討したところ、指示薬を細胞膜に局在させる事で刺激応答後の細胞も検出できることを明らかにした。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Identification of polyethylene glycol-resistant macrophages on stealth imaging in vitro using fluorescent organosilica nanoparticles (2015)
  • Author(s): Nakamura M, Hayashi K, Nakano M, Kanadani T, Miyamoto K, Kori T, Horikawa K.
  • Journal Title: ACS Nano. Volume: 9 Issue: 2 Pages: 1058-1071
  • DOI: 10.1021/nn502319r
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Recent progress in the development of genetically encoded Ca²⁺indicators (2015)
  • Author(s): Horikawa K
  • Journal Title: The Journal of Medical Investigation Volume: 62 Issue: 1.2 Pages: 24-28
  • DOI: 10.2152/jmi.62.24
  • NAID: 130005129691
  • ISSN: 1343-1420, 1349-6867
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] In vivo visualization of subtle, transient and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca2+ indicator. (2014)
  • Author(s): Kanemaru K, Sekiya H, Xu M, Satoh K, Kitajima N, Yoshida K, Okubo Y, Sasaki T, Moritoh S, Hasuwa H, Mimura M, Horikawa K, Matsui K, Nagai T, Iino M, Tanaka KF
  • Journal Title: Cell Rep Volume: 8(1),311 Issue: 1 Pages: 311-318
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2014.05.056
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Genetically encoded Ca2+ indicators; expanded affinity range, color hue and compatibility with optogenetics. (2014)
  • Author(s): Nagai T, Horikawa K, Saito K, Matsuda T
  • Journal Title: Frontiers in Neuroscience Volume: 7 Pages: 25-25
  • DOI: 10.3389/fnmol.2014.00090
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Fluorescent probes for bio-imaging of bone (2014)
  • Author(s): Kazuki Horikawa
  • Journal Title: THE BONE Volume: Vol.28 No.2
• [Journal Article] Spatiotemporal regulation of Ca2＋ dynamics in live cells revealed by Ca2＋ imaging. (2014)
  • Author(s): Kazuki Horikawa and Takeharu Nagai
  • Journal Title: CLINICAL CALCIUM Volume: Apr;23(4) Pages: 527-533
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 生理機能を可視化するFRETプローブの開発 (2014)
  • Author(s): 堀川一樹
  • Organizer: 第55回 日本生化学会 中国・四国支部例会
  • Place of Presentation: 愛媛大学（愛媛県松山市）
  • Year and Date: 2014-06-06
  • Invited
• [Presentation] ライブイメージングを容易にする高機能性指示薬の開発 (2014)
  • Author(s): 堀川一樹
  • Organizer: 第91回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 鹿児島大学（ 鹿児島県）
• [Presentation] 2個の細胞で多細胞は作れるか：細胞性粘菌の多細胞化を可能にする細胞の数 (2013)
  • Author(s): 佐藤朗、堀川一樹
  • Organizer: 第36回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場（ 兵庫県）