非破壊的可視化による配偶子インテグリティの予見

• 研究領域: 配偶子インテグリティの構築
• 研究課題/領域番号: 18H05550
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 筑波大学
• 研究代表者: 八幡 穣 筑波大学, 生命環境系, 准教授 (10586457)
• 研究期間 (年度): 2018-06-29 – 2023-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 94,900千円 (直接経費: 73,000千円、間接経費: 21,900千円); 2022年度: 17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円); 2021年度: 17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円); 2020年度: 18,200千円 (直接経費: 14,000千円、間接経費: 4,200千円); 2019年度: 17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円); 2018年度: 24,830千円 (直接経費: 19,100千円、間接経費: 5,730千円)
• キーワード: 配偶子 / 自家蛍光 / 一細胞解析 / 卵子 / 体外培養 / 自家蛍光解析 / 非破壊評価 / in vitro gametogenesis / 非破壊分析 / 共焦点顕微鏡 / 内在性蛍光 / 可視化技術 / 機械学習 / CRIF / インテグリティ / 顕微鏡

研究実績の概要

３つの研究項目を、それぞれ下記の計画で推進した
1)原始卵胞など立体的組織の内在性蛍光パターンを解析できる３次元解析手法の基盤構築：昨年度は、内在性蛍光パターンをスキャンするために、４つの励起波 長で順番に組織内を照明し、それぞれの励起波長について戻ってきた蛍光の強さと波長を記録する顕微鏡制御プログラムの作成が完了した。そこで本年度度はこれ をさらに発展させ、得られた画像から内在性蛍光パターンを分析しその３次元分布をマッピングするアルゴリズムを作成した。
２）in vitroで産生された卵子の内在性蛍光パターンの分析：昨年度の実験により、in vitroでPGCから産生されたマウス卵子集団内の一細胞ごとに内在性蛍光パターンを観測して記録した後に、観察した卵子を回収し、発生能解析を行った結果、内在性蛍光の解析が発生能に影響を与えないことが確認された。そこで本年度は同様の実験系を用いて、内在性傾向パターンと胚盤胞への発生能を紐付けたデータを取得した。本実験については領域内で相互にin vitro卵子成熟技術および顕微鏡可視化技術の技術移転を行い研究の効率化を図った。
３）器官培養された精巣で形成されたマウス精子の内在性傾向パターンの分析: マウス精巣の内在性蛍光パターンの分布の可視化は、内在性蛍光パターンに基づいて精巣内の精原細胞の状態を評価するための不可欠の技術であるが、昨年度の研究からこの実証が成功している。そこで、本年度は精原細胞にGFPマーカーを挿入した組 み替え生物の精巣を用いて、観測された内在性蛍光パターンのアノテーションを行った。これについては領域内での連携により組み換え生物の精巣の提供を受けるこ とで、あらたな遺伝子組み換えのステップを省略し効率的に推進した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究は、次の３つの研究項目を推進する計画としている。具体的には、1)原始卵胞など立体的組織の内在性蛍光パターンを解析できる３次元解析手法の基盤構 築、２）in vitroで産生された卵子の内在性蛍光パターンの分析、３）器官培養された精巣で形成されたマウス精子の内在性傾向パターンの分析を主な目的としている。
本年度も、下に説明するようにそれぞれの項目における重要なマイルストーンを達成しており、概ね順調に進展している。具体的には、研究項目１では原始卵胞など立体的組織の内在性蛍光パターンを可視化できることが実証された。研究項目２では多数のin vitro 卵子とin vivo卵子の内在性蛍光パターンとその後の発生を紐付けたデータを取得し、比較のための基盤が整った。また研究項目３として計画研究２と連携し、器官培養された精巣内における自家蛍光の空間分布を可視化することに成功し、精巣内には異なる種類の細胞に対応すると思われる複数の自家蛍光パターンが存在することが明らかとなっているなど、当所の計画通りの進展が得られている。

今後の研究の推進方策

３つの研究項目を、それぞれ下記の計画で推進する。
1)原始卵胞など立体的組織の内在性蛍光パターンを解析できる３次元解析手法の基盤構築：本年度度はこれ をさらに発展させ、得られた画像から内在性蛍光パターンを分析しその３次元分布をマッピングするアルゴリズムを作成した。来年度はここから多変量分析および機械学習により細胞に特徴的な自家蛍光パターンを抽出するアルゴリズムの開発をすすめる。
２）in vitroで産生された卵子の内在性蛍光パターンの分析：本年度は同様の実験系を用いて、内在性蛍光パターンと胚盤胞への発生能を紐付けたデータを取得した。そこで来年度は内在性蛍光パターンと発生能との相関を多変量解析および機械学習を用いて分析する。
３）器官培養された精巣で形成されたマウス精子の内在性傾向パターンの分析: 本年度は精原細胞にGFPマーカーを挿入した組み替え生物の精巣を用いて、観測された内在性蛍光パターンのアノテーションを行った。本年度はセルトリ細胞のアノテーションを行うために、精巣の位置を維持したまま免疫染色と自家蛍光観察を行うための技術を開発する。

研究成果

• [雑誌論文] Intra- and Interspecies Variability of Single-Cell Innate Fluorescence Signature of Microbial Cell (2019)
  • 著者名/発表者名: Yawata Yutaka、Kiyokawa Tatsunori、Kawamura Yuhki、Hirayama Tomohiro、Takabe Kyosuke、Nomura Nobuhiko
  • 雑誌名: Applied and Environmental Microbiology 巻: 85 号: 18 ページ: 1-10
  • DOI: 10.1128/aem.00608-19
  • NAID: 120007133099
  • 査読あり
• [学会発表] Single-Cell Innate Fluorescence Analysis by Confocal Microspectroscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: Yutaka Yawata
  • 学会等名: TSB2019
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Single-Cell Innate Fluorescence Analysis by Confocal Microspectroscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: Yutaka Yawata 、Kyosuke Takabe、Nobuhiko Nomura
  • 学会等名: - 日本顕微鏡学会第62回シンポジウム
  • 招待講演
• [備考] 八幡研究室
  • URL: https://yawatalab.jp