| 研究領域 | 全能性プログラム：デコーディングからデザインへ |
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| 研究課題/領域番号 |
19H05755
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| 研究種目 |
新学術領域研究(研究領域提案型)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
生物系
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
新冨 圭史 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (60462694)
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| 研究期間 (年度) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
93,600千円 (直接経費: 72,000千円、間接経費: 21,600千円)
2023年度: 16,770千円 (直接経費: 12,900千円、間接経費: 3,870千円)
2022年度: 16,770千円 (直接経費: 12,900千円、間接経費: 3,870千円)
2021年度: 16,770千円 (直接経費: 12,900千円、間接経費: 3,870千円)
2020年度: 16,770千円 (直接経費: 12,900千円、間接経費: 3,870千円)
2019年度: 26,520千円 (直接経費: 20,400千円、間接経費: 6,120千円)
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| キーワード | カエル卵抽出液 / 細胞周期 / 再プログラム化 / 染色体 / 再構成 / 核の再プログラム化 / 無細胞系 / 卵割周期 / 胚性遺伝子活性化 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
受精卵では核の構造が大きく変化します。こうして核が再プログラム化されると、細胞があらゆる組織へと分化するポテンシャル「全能性」が得られます。これまで、私たちはカエル卵の抽出液を使って、核の再プログラム化を試験管内で再現する方法を開発し、そのしくみを分子レベルで理解する準備を整えてきました。この研究では、独自の方法を使って、卵に存在するどのタンパク質が、どのような化学反応を通じて、再プログラム化をもたらすのかを明らかにします。さらに、得られた知見をもとにして、さまざまな組織に由来する細胞の核を再プログラム化し、人為的に全能性を与えることにも挑戦します。
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| 研究実績の概要 |
マウスなどの哺乳類では、体細胞由来の核を除核した卵に移植してクローン個体を作出することができる。しかし、この方法によるクローン作出の成功率は良くても20%程度であり、クローン作出の背景にある分子メカニズムの理解とそれに基づく技術の改良が求められている。本研究では、特に、卵の細胞質に存在する因子がドナー核のクロマチンに働きかけ、DNA複製が開始するまでの過程で起こる生化学反応に着目して解析を行なってきた。これまでに達成した実績の概要は以下の通りである。
（1）実験系の確立。赤血球核をカエル卵から調製した分裂期抽出液と混和すると、核膜崩壊の後に染色体が作られる。さらにその後、抽出液の細胞周期を間期に移行させると、100%の効率でDNA複製が誘起できた。体細胞核と分裂期卵細胞質の相互作用によって、クローン作出に不可欠なクロマチンの質的変化を再現できた。
（2）体細胞核から分裂期染色体への変換に不可欠なタンパク質の絞り込み。通常の増殖細胞での染色体構築に不可欠なコンデンシンやトポⅡ以外の関与を調べた。クロマチンリモデリング因子ISWIを卵抽出液から除くと、赤血球核から作られる染色体様各々の構造が個別化が阻害されることがわかった。
（3）染色体個別化のメカニズムの検討。ISWIによるヌクレオソームのスライディング反応に拮抗的に働くリンカーヒストンH1.8に着目して解析を行った。上記の実験系でH1.8除いた場合には個別化が促進されるのに対し、過剰量のH1.8を添加すると個別化が阻害された。したがって、クローン作出時のクロマチン構造変化には、リンカーヒストンとリモデリング因子にバランスによるヌクレオソームの動的性質の調節が重要であることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
クローン作出におけるドナー核の動態を解析するために実験系を確立し、クローン作出に不可欠と考えられる卵由来タンパク質の絞り込みに成功した。それらの作用メカニズムに解析も進んでおり、さらに詳細な解析をするために必要となる試料の調製も終えることができた。ただし、最終年度を迎え、成果をまとめて論文にするために、いくつかの解析が必要な状況であるため。
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| 今後の研究の推進方策 |
カエル卵抽出液の無細胞系を用いると、体細胞核移植における核の再プログラム化を試験管内で再現できる。とくに、本計画では、終末分化した体細胞（赤血球）の核を卵割周期に適応させる方法に着目してきた。この方法では、卵抽出液の細胞周期を精緻に操作することが再プログラム化の成否を決めることが知られている。例えば、赤血球核を分裂期抽出液と混和すると、いったん核膜が崩壊した後に、ロッド状の染色体が作られる。さらにその後、間期に移行させて核を再形成させれば、100%の効率でDNA複製が誘起できる。しかし、間期の抽出液に直接赤血球核を加えても複製が起こらない。興味深いことに、実際の核移植ではドナー核を分裂期のレシピエント胚に移植しなければならないことが知られており、卵抽出液と赤血球核を組み合わせた無細胞系は再プログラム化の分子メカニズムを理解するために理想的な実験系と言える。
これまでに行った実験では、赤血球核を分裂期卵抽出液と混和した後、細胞周期を間期へと移行させと、複製の再開だけではなく、核サイズや核膜孔密度の増大、ヘテロクロマチンの核内分布の変化が起こることが明らかになっている。さらに、これらの特徴的な形態変化と分裂期おける染色体の個別化の関連も示唆されている。本年度は、分裂期の染色体個別化を制御するリンカーヒストンとリモデリング因子ISWIを卵抽出液から除去し、それらの変異体に置き換える実験を中心に行う。すでに、解析に必要なリコンビナントタンパク質の調製を終えている。変異体への置換によって、分裂期染色体の個別化、その後の間期における核の形態やDNA複製に、どのような影響が生じるのかを解析する。最終的に得られた結果を総合し、原著論文として発表することを目指す。
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