| 研究領域 | クロススケール新生物学 |
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| 研究課題/領域番号 |
21H05256
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| 研究種目 |
学術変革領域研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
学術変革領域研究区分(Ⅲ)
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| 研究機関 | 日本医科大学 (2022-2024)
東京大学 (2021) |
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研究代表者 |
山本 林 日本医科大学, 大学院医学研究科, 大学院教授 (80551283)
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| 研究期間 (年度) |
2021-09-10 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
70,590千円 (直接経費: 54,300千円、間接経費: 16,290千円)
2024年度: 12,740千円 (直接経費: 9,800千円、間接経費: 2,940千円)
2023年度: 12,870千円 (直接経費: 9,900千円、間接経費: 2,970千円)
2022年度: 12,740千円 (直接経費: 9,800千円、間接経費: 2,940千円)
2021年度: 19,370千円 (直接経費: 14,900千円、間接経費: 4,470千円)
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| キーワード | クロススケール / メゾ複雑体 / オートファジー / LLPS / Fluidophagy / 液滴 / マクロオートファジー / ミクロオートファジー / メゾスケール |
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| 研究開始時の研究の概要 |
哺乳類では選択的オートファジーによる細胞内クリアランスが恒常的に行われている。基質が作る液滴を選択的に分解する液滴オートファジー（Fluidophagy）では、液滴と膜の相互作用によってオートファゴソームの膜変形が促されるが、その分子メカニズムは不明である。本研究では、最先端のIn-cell計測技術によって、液滴と膜の相互作用を細胞内のありのままの状態で、ミクロスケールからメゾスケールまでシームレスに定量解析することで、「液滴による膜変形の分子メカニズム」と「膜変形に伴う液滴の標的化メカニズム」の解明を行う。
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| 研究実績の概要 |
(1) オートファゴソーム膜変形を促す因子のIn-cell、On-membrane解析：鉄貯蔵タンパク質であるフェリチンがNCOA4とともに液滴を形成し、マクロオートファジーとミクロオートファジーの共通基質になることを論文として報告しており、このフェリチン液滴がp62液滴とアダプタータンパク質を共有していることを見出した。フェリチン液滴およびp62液滴の構成因子について誘導性発現HeLa細胞を作成し、これらの液滴同士が隣り合った状態を効率的に作り出す方法を確立しており、個々の液滴の性状に関するin vitroおよびin vivoの解析・計測を領域内共同研究で進めている。
(2) ２つのオートファジーでの「仕分け」と選択的オートファジー始動メカニズムの解析：フェリチン液滴がミクロオートファジー経路に選択的に移行するためのアダプターを複数同定しており、各因子のノックアウトの組み合わせにより、フェリチン液滴ミクロオートファジーとp62液滴ミクロオートファジーの基質認識メカニズムの一部を明らかにした。また、TAX1BP1によるオートファジー関連タンパク質のリクルートメカニズムの解析を行い、ATG9小胞上のSCAMP3がTAX1BP1と相互作用することでATG9小胞をリクルートすることを明らかにした（論文リバイス中）。
(3) 新規蛍光プローブを利用した液滴オートファジー定量法とスクリーニング系の確立：領域内共同研究で開発されたpH応答性蛍光プローブをHaloTag-NCOA4およびHaloTag-p62に導入し、両経路に関わる新規因子のCRISPR スクリーニングを継続して行っている。また、領域内共同研究で新規手法によるマイトファジー誘導実験を行った（論文リバイス中）。
(4) エンドソームミクロオートファジー経路の新規基質の検索：RAB5Q79L誘導性発現による肥大化エンドソームには、フェリチン液滴やp62液滴のほかにも複数の基質が取り込まれることを見出しており、新規分解基質のスクリーニングを進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
フェリチン液滴がマクロオートファジーとミクロオートファジーの共通基質になる分子メカニズムについて論文報告した後も継続して研究を進め、両経路に仕分けされる際のアダプタータンパク質の機能を明らかにするなど、これまで不明であったマクロオートファジーとミクロオートファジーのクロストークについて新たな知見を得ている。さらに、フェリチン液滴だけでなく、他の液滴基質まで解析を拡大する予定で、研究全体としておおむね順調に進展している。また、昨年度に論文報告したHaloTag型の新規オートファジー活性定量プローブを利用したスクリーニング系を新たに確立しており、研究は順調に進んでいる。一方、in-cellでの液滴の性状解析については、必要なノックイン細胞を作成するなど計画に合わせて進めているが、計測そのものは難易度が高く、今後のさらなる改善が必要である。また、TAX1BP1相互作用因子の同定など新たな展開もあり、研究全体としておおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度までに作成した形状ラベル（HaloTag）ノックイン細胞を用いて、本領域の目標である液滴オートファジーのin-cell解析を進める。また、液滴ミクロオートファジー特異的因子（マクロオートファジーとミクロオートファジーの仕分けを制御する因子）を同定しており、その機能解析を継続するが、この解析はフェリチン液滴だけでなく他の液滴まで拡大することを計画しており、これまで分子レベルでの切り分けができていなかったマクロオートファジーとミクロオートファジーの仕分けおよびクロストークについて分子メカニズムを明らかにするとともにその一般化を目指す。また、新規の液滴基質のスクリーニングを進めており、このスクリーニングで同定された液滴因子についても同様の解析に供する予定である。これらの解析を通してミクロオートファジーの生理的意義の解明まで研究を拡大し、さらに液滴の細胞外分泌へと解析を進める。
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