| 研究領域 | パラサイトミメティクス：寄生虫が持つ高度機能因子の同定とその利用 |
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| 研究課題/領域番号 |
22H05059
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| 研究種目 |
学術変革領域研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
学術変革領域研究区分(Ⅲ)
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
八田 岳士 北里大学, 医学部, 准教授 (00455304)
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| 研究期間 (年度) |
2022-05-20 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
40,170千円 (直接経費: 30,900千円、間接経費: 9,270千円)
2024年度: 13,390千円 (直接経費: 10,300千円、間接経費: 3,090千円)
2023年度: 13,390千円 (直接経費: 10,300千円、間接経費: 3,090千円)
2022年度: 13,390千円 (直接経費: 10,300千円、間接経費: 3,090千円)
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| キーワード | 吸血性節足動物 / 唾液 / 薬理物質 / 創薬研究 / 外部寄生虫 / 唾液分子 / 産業応用 / ヒスタミン結合タンパク質 / マダニ / 昆虫細胞分泌発現系 / piggyBac / 免疫抑制 / 抗血液凝固 / 血管新生抑制 / ワクモ |
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| 研究開始時の研究の概要 |
宿主動物に対し「寄生されていることすら気づかせない」寄生生物が独自に発達させた生存様式については、未だ十分に着目されているとはいいがたい。とりわけマダニ等の吸血性節足動物が保有する唾液生理活性物質については、医薬品としての創薬を前提に多くの有用分子が発掘されてきた経緯があるにもかかわらず開発途上の段階にある。そこで本研究では、吸血性節足動物、特にマダニの唾液物質における抗アレルギー作用、血管新生抑制作用および抗血液凝固作用について、Functional Screeningを中心に研究を推進し、既存薬との対比を行うことで革新的な「マダニ唾液物質由来の創薬R&D」を目指す。
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| 研究実績の概要 |
マダニは長期間の吸血において多種多様な薬理物質を宿主体内に放出する。本研究は、①抗アレルギー物質、②抗血液凝固物質、③血管新生抑制物質に関連するマダニ唾液分子について、分子機能・構造など科学的根拠に裏付けられた新薬創製のシーズを得ることを目的としている。本年度は、ヒスタミン結合蛋白質の機能解析を主に行った。フタトゲチマダニ唾液腺発現遺伝子のESTデータベースに対し、HLCBP1をクエリとしたBlastn解析を行い、E-valueが0.00001未満となる遺伝子10個を選出した。これらについて、唾液腺におけるmRNA発現解析を行ったところ、8個の遺伝子で吸血刺激による発現の上昇を認めた。遺伝子配列をもとに機能予測を行ったところ、S02086A-40_F06の予測アミノ酸配列に、Histamine結合ドメインが保存されていることが分かった（以下、HLHBP1とする）。HLHBP1遺伝子ノックダウン（KD）マダニにおける吸血や産卵などの表現型解析を実施したところ、対照群よりも吸血時の成長が抑制される現象を認めたが飽血時体重は有意に重くなっていた。予備データではあるが、刺咬部位皮膚では肥満細胞およびT細胞が顕著に集簇していたことから、対照群とは異なる炎症性変化が生じている可能性がある。次に本分子の組換えタンパク質の発現系の構築を行った。昆虫細胞系での高レベル分泌発現を企図し、まずリーダーシグナルとしてメリチンを融合した分子キメラとして塩基配列をデザインした。本ベクターをSf9細胞へ導入し、1週間薬剤選択してから培養上清中を解析したところ、HLHBP1の分泌発現を確認することができた。今後、高レベル発現を企図して、本キメラ遺伝子をトランスポゾンpiggyBacの末端逆位配列の間に導入したベクターを構築し、ヘルパーとともにトランスフェクトしたSf9細胞を作出することを計画している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
HLCBP1の組換えタンパク質の機能確認が進んでいない。そのため、次点で進めていたHLHBP1に注力することとなった。昆虫細胞を用いた安定発現系の構築に至ったが、今後先行していたHLCBP1の分子機能解析についても進めていく。このため、当初計画とは異なる手段をとることとなったため、やや遅れているという評価となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
HLHBP1のpiggyBacを利用した高レベル分泌蛋白質発現系の構築をベンチマークとして、解析の遅れているHLCBP1についても分子機能解析を進める。具体的には以下の実験系を進めていく予定である。
①抗アレルギー物質の機能解析（特にHLHBP1）：マダニ唾液分子発現Sf9細胞の培養上清、または精製タンパク質を用い、炎症性メディエーターに対する結合能について評価を行う。
②抗止血物質の解析：上記と同様の培養上清を用い、APTT法やPT法などのクロット析出時間を指標に評価する。
③血管新生抑制物質の解析：上記と同様の培養上清を用い、HUVECなどの血管内皮細胞の
増殖率や脈管形成率を指標に評価する。
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