| 研究領域 | 時間タンパク質学：多様な「時」を生み出すタンパク質マシーナリー |
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| 研究課題/領域番号 |
24H02305
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| 研究種目 |
学術変革領域研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
学術変革領域研究区分(Ⅲ)
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
大出 晃士 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 講師 (40612122)
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| 研究期間 (年度) |
2024-04-01 – 2029-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2025年度)
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| 配分額 *注記 |
63,700千円 (直接経費: 49,000千円、間接経費: 14,700千円)
2026年度: 14,170千円 (直接経費: 10,900千円、間接経費: 3,270千円)
2025年度: 14,690千円 (直接経費: 11,300千円、間接経費: 3,390千円)
2024年度: 4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円)
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| キーワード | CaMKII / リン酸化酵素 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
神経可塑性制御に中心的な役割を果たすリン酸化酵素であるCaMKIIは、神経発火に伴うミリ秒スケールのカルシウム刺激に対してミリ秒スケールで応答する。しかし、CaMKIIは睡眠など、より長い時間スケールの生理応答にも関与している。本研究では、数十分にわたる長い時間スケールのCaMKIIの応答特性の理解と改変を行い、CaMKIIがミリ秒スケールのカルシウム刺激を、長い時間スケールの生化学的応答に変換・積算する機構を理解する。
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| 研究実績の概要 |
本研究は、旧来の研究が着目してきたミリ秒スケールではなく、数十分にわたる長い時間スケールのCaMKIIの応答特性の理解と改変を行い、CaMKIIがミリ秒スケールのカルシウム刺激を、長い時間スケールの生化学的応答に変換・積算する機構をアミノ酸残基レベルで理解することを目的としている。本年度は、まずCaMKIIの活性持続長を延長させることを見出している低分子化合物について、既知のCaMKII立体構造情報から低分子化合物が結合する可能性があるポケットを推測し、このポケット周辺へのアミノ酸変異を導入した変異CaMKIIシリーズを作製した。作製した変異体シリーズについて、CaMKIIの活性持続長を測定したところ、予想通り活性持続長が変化した。このことから、CaMKIIの活性持続長制御に関わる分子内ポケット領域を推定することに成功した可能性がある。しかしながら、特に活性持続長の延長については、野生型と比較して大きな変化は観察されておらず、活性持続長変化をもたらす制御機構についての詳細な知見を得るためには、さらなる変異体シリーズのデザインが必要である。
また本年度は、CaMKIIの構造変化をリン酸化活性とは別の方法で検出するために、Protein Thermal Shift Assayを導入した。その結果、CaMKIIの活性化に必要なCaM結合によるCaMKIIの構造変化を明瞭に捉えることに成功した。さらに、CaMKII活性化の様式を、より生理学的な条件で捉えるために、高密度電極アレイ上に播種した神経細胞に、効率的に同期発火を生じさせる条件を検討した。
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
2: おおむね順調に進展している
理由
CaMKIIの活性持続長変化をメカニズムを問うにあたって、持続長が変化した変異体および、活性持続長変化と相関する可能性があるタンパク質構造変化を捉える実験系を整備することができた。これらは、本計画の基盤となるものであり、初年度としては概ね順調な進行であると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
概要に記したように、本年度得られたCaMKII変異体の、活性持続長変化の程度は十分とは言い難い。そこで、本年度得られた責任残基情報を用いて、さらなる変異体シリーズ作製を行い、野生型CaMKIIと比較して２倍以上程度、活性持続長変化が生じる変異体を得ることを第一の目標とする。ここで明瞭な活性持続長変化を示す変異体を得ることが、そのあとの生化学解析や生理学的意義を問う実験を間違いなく遂行するために重要である。また、Protein Thermal Shift Assayについては、現在は温度変化に対するシグナル変化からタンパク質構造の熱安定性を検出する設計であるが、これを変更して、等温条件下でリアルタイムモニタリングを行うことで、構造変化の時系列変動を追跡するアッセイ系の構築を行う。これによりCaMKIIのリン酸化活性変動と構造変化の時系列上の対応関係を調べる。
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