| 研究概要 |
一部の植物では,クロロフィル分解の初期反応においてフェオホルビドaはピロフェオホルビドaへと分解されることが知られている.この反応は維管束植物では酵素的な加水分解と自発的な脱炭酸反応の2段階の反応による.この加水分解反応を触媒する酵素をフェオホルビダーゼと名付け,研究を行っている.本酵素は老化によって誘導されるものと構成的に存在するものの2種類があり,FPLCを用いて高度に精製をした.ダイコン(Raphanus sativus)の子葉から,老化誘導型,構成型はそれぞれ10,000倍と6,500倍に精製できた.フェオホルビダーゼのサブユニットは77kDaであるが,サンプル調製時に熱処理することで,SDS-PAGEにおいて16.8,15.9,11.8kDaの3つのバンドを得た.高度な精製標品の断片化されたペプチドを用いて部分アミノ酸配列の解析を行い,2種類のアミノ酸配列の決定に成功した.決定したアミノ酸配列をもとにプライマーを設計し,RT-PCRによって部分ヌクレオチド配列を得た.さらに,3'-RACE,5'-RACEを組み合わせて,フェオホルビダーゼ遺伝子のクローニングを行っている.現在までに明らかになったヌクレオチド配列を用いてBLASTサーチを行ったところ,ダイコンのフェオホルビダーゼと高い相同性を持つものがシロイヌナズナに存在し,このことは酵素活性の植物分布とも一致していた.今後は,大腸菌を用いた大量発現系の構築を行い,得られたタンパクを用いて抗体作成を行う.また,ウエスタン,ノーザン解析を行い,フェオホルビダーゼの発現調節機構を解明していく予定である.
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