マラリアワクチン開発へ向けての抗原・抗体分子複合体のX線構造研究

• 研究課題/領域番号: 01044086
• 研究種目: 国際学術研究
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 共同研究
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 冨田 研一 大阪大学, 薬学部, 教授 (30028831)
• 研究分担者: AKANMORI Bar カ゛ーナ大学, 野口英世記念医学研究所(カ゛ーナ、レゴン), 研究員 ; ARMAH George カ゛ーナ大学, 野口英世記念医学研究所(カ゛ーナ、レゴン), 研究員 ; POLJAK Rober ハ゜スツール研究所, 免疫構造部門(フランス、ハ゜リー), 教授 ; 堀井 俊宏 大阪大学, 微生物病研究所, 助教授 (80142305) ; 小俣 吉孝 帯広畜産大学, 原虫病分子免疫研究センター, 助手 (10132987) ; 上杉 晴一 横浜国立大学, 工学部, 教授 (70028851) ; 山縣 ゆり子 大阪大学, 薬学部, 助手 (40183678) ; 箱嶋 敏雄 大阪大学, 薬学部, 助手 (00164773) ; 藤井 敏 大阪大学, 薬学部, 助教授 (10107104) ; AKANMORI Barthoromew D. Research Fellow, Noguchi Memorial Institute for Medical Research, University of ; POLJAK Robe パスツール研究所, 兔疫構造部門, 教授
• 研究期間 (年度): 1989 – 1991
• 研究課題ステータス: 完了 (1991年度)
• 配分額: 10,100千円 (直接経費: 10,100千円); 1991年度: 3,300千円 (直接経費: 3,300千円); 1990年度: 3,300千円 (直接経費: 3,300千円); 1989年度: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
• キーワード: マラリアワクチン / マラリア原虫表皮蛋白質抗原 / モノクロ-ナル抗体Fab / 抗原・抗体および抗原・抗体複合体の結晶化 / X線結晶構造解析 / H鎖アミノ酸配列 / マラリア原虫表皮蛋白質 / 融合蛋白質抗原 / モノクロ-ナル抗体 / 抗原・抗体複合体

研究概要

マラリアは、蚊が媒介する病気で、熱帯地方では今なお毎年数百万人が死亡している。1984年にマラリア原虫スポロゾイト表皮蛋白質のアミノ酸配列が決定されたので、本研究ではこの表皮蛋白質中の繰返し配列部位を抗原に選び、マウスにそのモノクロ-ナル抗体を作らせ、抗原・抗体反応を両者の分子複合体のX線結晶構造解析法によって明らかにし、マラリアワクチンとしての有効性について免疫学的研究を行うことを目的とする。そこで本研究期間(平成元年〜平成3年度)に達成できた研究成果について以下に列挙する。
平成元年度の成果:
(1)マラリア原虫(P.falciparum)表皮蛋白質の繰返しアミノ酸配列[(ProーAsnーAlaーAsn)_8(ProーAsnーValーAsp)_2:CSPー1]の遺伝子をヒト成長ホルモン遺伝子の下流の組込み、大腸菌で融合蛋白質(FP)として大量に産生させ、その溶液中での二次構造をCD法で明らかにした。
(2)上記FPおよびCSPー1の活性として、ELISA法を用いて、マラリア感染ヒト血清および抗マラリア原虫表皮蛋白質抗体(Walter Reed陸軍研究所より供与)に対する結合能を測定したところ、FPの方がCSPー1よりも結合能が高いことが判明した。
(3)研究代表者冨田と研究協力者G.E.Armahは、パスツ-ル研究所(分担者R.J.Poljak教授)およびガ-ナ大学野口記念医学研究所において抗原の結晶化およびスポロゾイトの採集計画について調査・研究を行った。(期間:平成元年9月12日〜10月10日)
平成二年度の成果:
(1)FPを抗原とし、マウスに抗体を産生させた後、細胞融合によってモノクロ-ナル抗体を選別し、2種のモノクロ-ナル抗体を得たが、いづれもFPおよびCSPー1に高い結合能を示した。
(2)上記モノクロ-ナル抗体をパパインで限定分解し、Fab部位を得た後、種々の沈殿剤を用いて迎晶化を試み、Fabの微結晶を得た。
(3)研究代表者冨田および分担者小俣は、パスツ-ル研究所とガ-ナ大学野口記念医学研究所(分担者G.E.Armah博士)でFabのアミノ酸配列、モノクロ-ナル抗体の免疫学的研究などの調査・研究を行った。(期間:平成2年9月25日〜10月18日)また分担者R.J.Poljak教授(パスツ-ル研究所)を招へいし、大阪大学、北海道大学、東京大学において「抗原・抗体分子複合体のX線研究」についての討論ならびに講演を行った。(期間:平成2年8月14日〜8月23日)
平成三年度の成果:
(1)CSPー1はB細胞エピト-プであるが、ワクチンとして働くためにはT細胞エピト-プも抗原に含まれねばならないと考え、マラリア原虫表皮蛋白質中に見出されたT細胞エピト-プ領域のアミノ酸配列に対応する遺伝子をCSPー1遺伝子の下流に組込み、この新しい融合蛋白質(FPー1)を大腸菌で大量発現させた。
(2)昨年度に研究を開始したFab部位のH鎖のアミノ酸配列の決定を続け、H鎖をコ-ドするcDNAをPCR法によって増幅し、その塩基配列→アミノ酸配列を決定することができた。variable領域を除いて他の抗体H鎖のアミノ酸配列との相同性が見出された。
(3)研究代表者冨田および分担者堀井は、パスツ-ル研究所、ガ-ナ大学野口記念医学研究所などにおいて、抗原・抗体分子複合体の結晶化、蚊より採集したスポロゾイトと抗体との免疫応答に関する調査・研究を行った。(期間:平成3年10月21日〜11月13日)また分担者G.E.Armah博士を招へいし、大阪大学においてFab、FPの結晶化についての討論および実験を行った。(期間:平成4年1月26日〜2月11日)
以上のように、3年間に得られた成果は大きいものの、研究目的達成までは、まだ程遠い感がする。研究代表者冨田は、平成4年3月に大阪大学薬学部を違年退官するが、今後も本研究を継続して行いたいと考えているし、大阪大学薬学部、微生物病研究所などには、本研究の一部を分担して現在も研究を続けている教官や学生が残っているので、平成5年度科学研究費補助金(国際学術研究)に再び新規に応募し、是非とも本研究を完成させ、マラリア撲滅のためにいささかでも貢献したいと考えている。

研究成果

• [文献書誌] G.E.Armah et al.: "The synthesis,cloning and expression of a repeating segment of the circumsporozoite surface protein of Plasmodium falciparum." Nucleic Acids Res.,Symposium Series.19. 165-169 (1988)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 冨田 研一: "蛋白質工学:X線による蛋白質の高次構造解析" 実験医学. 6. 488-493 (1988)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] M.I.Ramos et al.(Y.Omata): "Plasmodium falciparum: Characterization of a 33-kDa soluble antigen." Experimental Parasitology.68. 297-307 (1989)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] M.B.Lascombe et al.(R.J.Poljak): "The three-dimensional structure of Fab R1..9,a monoclonal murine antibody specific for the p-azobenzenearsonate group." Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86. 607-611 (1989)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] W.B.Li et al.(T.Horii): "Structure and expression of the Plasmodium falciparum SERA gene." Mol.Biochem.Parasitology.33. 13-26 (1989)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] J.Inselburg et al.(T.Horii): "Studies of Plasmodium falciparum dihydrofolate-reductase thymidylate synthase: Potential advantages." Malaria and the Red Cell.2. 29-43 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] G.Boulot et al.(R.J.Poljak): "Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the bacterially expressed Fv from the monoclonal anti-lysozyme antibody and of its complex with lysozyme." J.Mol.Biol.213. 617-619 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] G.E.Armah et al.: "Conformation and immunogenicity of engineered repeating segment of the circumsporozoite surface protein of Plasmodium falciparum." Mol.Biochem.Parasitology.38. 135-140 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] T.O.Fischmann et al.(R.J.Poljak): "Crystallographic refinement of the three-dimensional structure of the Fab D1.3-lysozyme complex at 2.5 Å resolution." J.Biol.Chem.266. 12915-12920 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] M.Satoh et al.(K.Tomita): "Molecular cloning nucleotide sequence and expression of the tuf B gene encoding elongation factor Tu from Thermus thermophilus HB-8." FEBS Letters.288. 98-100 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 冨田 研一: "マラリアワクチン開発へ向けての抗原・抗体分子複合体のX線構造研究" 学術月報. 45. 134-142 (1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 冨田 研一: ""核酸・蛋白質の構造情報"内田 久雄編 p.p.87ー116." 東大出版会, 1-255 (1989)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] G.E.Armah et al.: "in "Protein Engineering - Protein Design in Basic Research,Medicine and Industry",pp.69-74.(ed.M.Ikehara)" Japan Scientific Society Press / Springer Verlag, 1-355 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] 箱嶋 敏雄,冨田 研一: "新生化学実験講座2「X線回折」pp.311ー347" 東京化学同人, 1-422 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] G. E. Armah et al.: "The synthesis, cloning and expression of a repeating segment of the circumsporozoite surface protein of Plasmodium falciparum." Nucleic Acids Res. Symposium series.19. 165-169 (1988)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ken-ichi Tomita: "Protein Engineering : Three-dimensional structure analysis of protein by X-rays." JIKKEN IGAKU (Japaneses). 6. 488-493 (1988)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] M. I. Ramos et al. (Y. Omata): "Plasmodium falciparum : Characterization of a 33-kDa soluble antigen." Experimental Parasitology.68. 297-307 (1988)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] M. B. Lascombe et al. (R. J. Poljak): "The three-dimensional structure of Fab R19.9, a monoclonal murine antibody specific for the p-azobenzenearsonate group." Proc. Natl. Acad. Sci. USA.86. 607-611 (1989)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] W. B. Li et al. (T. Horii): "Structure and expression of the Plasmodium Falciparum SERA gene." Mol. Biochem. Parasitology.33. 13-26 (1989)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] G. Goulot et al. (R. J. Poljak): "Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the bacterially expressed Fv from the monoclonal anti-lysozyme antibody and of its complex with lysozyme." J. Mol. Biol.213. 617-619 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] G. E. Armah et al.: "Conformation and immunogenicity of engineered repeating segment of the circumsporozoite surface protein of Plasmodium falciparum." Mol. Biochem. Parasitology.38. 135-140 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] J. Inselburg et al. (T. Horii): "Studies of Plasmodium falciparum dihydrofolate-reductase thymidylate synthase : Potential advantages." malaria and the Red Cell.2. 29-43 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] M. Satoh et al. (K. Tomita): "Molecular cloning, nucleotide sequence and expression of the tuf B gene encoding elongation factor Tu from Thermus thermophilus." F E B S Letters.288. 98-100 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ken-ichi Tomita: "X-ray structural studies of antigen-antibody complex toward malaria vaccine development." GAKUJUTSU GEKKAN (Japanese). 45. 134-142 (1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ken-ichi Tomita: Tokyo University Press."Structural Information of Nucleic Acids and Proteins. ", 87-116 (1989)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] G. E. Armah et al.: Japan Scientific society Press/springer Verlag."protein Engineering-Protein Design in Basic Research, Medicine and industry", 69-74 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Toshio Hakoshima & Ken-ichi Tomita: Tokyo Kagakudojin. "X-ray diffraction" in "SHIN SEIKAGAKU JIKKEN KOZA" 2. (Japanese), 311-347 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] G.E.Armah,S.Nishikawa,C.Kondo and K.Tomita.: "The synthesis,cloning and expression of a repeating segment of the circumsporozoite surface protein of Plasmodium falciparum." Nucleic Acids Res.,Symposium Series,. 19. 165-169 (1988)
• [文献書誌] 冨田 研一: "蛋白質工学:X線による蛋白質の高次構造解析" 実験医学. 6. 488-493 (1988)
• [文献書誌] G.E.Armah,S.Nishikawa,S.Miki,Y.Omata,T.Nakabayashi and K.Tomita.: "Conformation and immunogenicity of engineered repeating segment of the circumsporozoite surface protein of Plasmodium falciparum." Mol.Biochem.Parasitol.,. 38. 135-140 (1990)
• [文献書誌] M.I.Ramos,Y.Omata,M.Igarashi and T.Nakabayashi: "Common Plasmodium falciparum antigen detected in in vitro culture supernatant." Ann.Trop.Med.Parasitol.,. 82. 393-395 (1988)
• [文献書誌] M.I.Ramos,Y.Omata,M.Igarashi and T.Nakabayashi: "Plasmodium falciparum: characterization of a 33ーkDa soluble antigen." Experimental Parasitology,. 68. 297-307 (1989)
• [文献書誌] Y.Omata,H.Oikawa,M.Kanda,K.Mikazuki,T.Nakabayashi and N.Suzuki.: "Experimental feline toxoplasmosis : Humoral immune responses of cats inoculated orally with Toxoplasma gondii cysts and oocysts." Jap.J.Vet.Sci.,. 52. 865-867 (1990)
• [文献書誌] G.Boulot,V.Guillon,R.A.Mariuzza,R.J.PolJak,M.M.Riottot and D.Tello.: "Crystallization of antibody fragments and their complexes with antigen." Journal of Crystal Growth,. 90. 213-221 (1988)
• [文献書誌] P.M.Alzari,M.B.Lascombe,and R.J.Poljak.: "Threeーdimensional structure of antibodies." Annual Reviews of Immunology. 6. 555-580 (1988)
• [文献書誌] G.A.Bentley,P.M.Alzari,A.G.Amit,G.Boulot,V.G.Chittarra,T.Fischmann,R.J.Poljak and D.Tello.: "Studies of structure and structure and specificity of some antigenantibody complexes." Phil.Trans.Royal Soc.London,. B323. 487-494 (1989)
• [文献書誌] G.A.Bentley,T.N.Bhat,G.Boulet,T.Fischmann,J.Navaza and R.J.Poljak.: "Immunochemical and crystallographic studies of antibody D1,3 in its free,antigenーliganded and idiotopeーbound states." Cold Spring Harbor Symposium,Quant.Biol.,. 54. 239-245 (1990)
• [文献書誌] T.N.Bhat,G.A.Bentley,T.O.Fischmann,G,Boulet and R.J.Poljak.: "Small rearrangements in structure of Fv and Fab fragments of antibody D1,3 on antigen binding." Nature,. 347. 483-485 (1990)
• [文献書誌] G.A.Bentley,G.Boulet,M.M.Riottot and R.J.Poljak.: "Threeーdimensional structure of an idiotopeーantiーidiotope complex." Nature,. 348. 254-257 (1990)
• [文献書誌] G.E.Armah,S.Nishikawa,C.Kondo,S.Miki,H.Nakabayashi and K.Tomita.: "in “Protein EngineeringーProtein Design in Basic Research,Medicine and Industry",p.p.69ー74.(ed.M.Ikehara)" Japan scientific Society Press/Springer Verlag(Tokyo,Berlin)., 1-355 (1991)
• [文献書誌] 冨田 研一: "“核酸・蛋白質の構造情報"内田久雄編 共著 P.P. 87ー116." 東大出版会, 1-255 (1989)