| 研究課題/領域番号 |
01044096
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| 研究種目 |
国際学術研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 共同研究 |
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
早津 彦哉 岡山大学, 薬学部, 教授 (10012593)
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| 研究分担者 |
根岸 友恵 岡山大学, 薬学部, 非常勤講師 (80116491)
根岸 和雄 岡山大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (70116490)
綿矢 有佑 岡山大学, 薬学部, 助教授 (90127598)
MORGAN A.R. Dept of Biochemistry Univ.of Alberta, Professor
別所 忠昌 岡山大学, 大学院・自然科学系研究科・生体調節科学専攻3年, 日本学術振興会特別研 (40211536)
平本 一幸 岡山大学, 薬学部, 日本学術振興会特別研 (50222253)
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| 研究期間 (年度) |
1989 – 1991
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| 研究課題ステータス |
完了 (1991年度)
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| 配分額 *注記 |
8,700千円 (直接経費: 8,700千円)
1991年度: 2,900千円 (直接経費: 2,900千円)
1990年度: 2,900千円 (直接経費: 2,900千円)
1989年度: 2,900千円 (直接経費: 2,900千円)
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| キーワード | DNA鎖切断 / DNAクロスリンク / 蛍光分析 / ニトロソアミン / 8ーメトキシソラレン / 近紫外光 / 突然変異 / 蛍光光度分析 / DNAー本鎖切断 / 光 / 活性酸素 / 遺伝子損傷阻害物質 / フォスゲン / 螢光分析法 / 細胞内DNA / ショウジョウバエ |
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| 研究概要 |
本研究が開始された平成元年度の時点で、われわれの研究室ではゲル電気泳動法によるDNA鎖切断検出をしていた。しかし本研究室の主題である蛍光光度計によるDNA鎖切断とクロスリンクの検出をアルバータ大学との共同研究により習得した現在では、この方法によって手軽にこれらのDNA損傷を検出するようになった。
まず平成元年度には、本方法の開発者であるA.R.Morganを招聘し、岡山大学において解説を受けた。この時Dr.Morganが行なった実験で、ファージM13の突然変異をテトラニトロメタンは変異原性はあるがDNA鎖切断はないという知見を得た。さらに年度の終わり近くから平成2年度の初めにかけて、分担者平本一幸がアルバータ大学で実験を行ない、フォスゲンにDNAクロスリンク作用があることを見出した。この結果は現在さらにフォローアップしている。平成元年度には情報収集のための海外派遣として早津彦哉(代表研究者)がアメリカ合衆国の各地に行き、新しい遺伝子損傷物質とそれに対する阻害物質に関する多くの情報を得た。その成果は平成2年度に作成した単行本“Mutagens in FoodーDetection and Prevention"(Hayatsu,H.,ed.,CRC Press)に集約されている。
平成2年度には、早津彦哉がアルバータ大学で研究を行ない、発がん性ニトロソアミン類をDNAと混ぜ、蛍光ランプをあてるとDNA鎖切断が起こることを見出した。それ以前にすでにわれわれは、ニトロソアミンと近紫外光の共同作用によってDNA鎖切断が起こることは見出していたが、蛍光ランプの光でも起こることはここで初めてわかった。しかしこの結果は短期間の実験で得られた予備的な観察であり、さらに確かめる必要があった。そこで岡山大学においてゲル電気泳動法、また後に取り入れて実行可能になった蛍光測定法によって詳しく実験を行なった結果、上記の観察の正しかったことが確認され、さらにこれがニトロソアミン類全般について認められる反応であることが明らかとなった。
平成2年度の終り頃から平成3年度の初めにかけて、当研究室で蛍光分析ができるように、分担者根岸和雄と綿矢有佑が努力し、その結果アルバータ大学のシステムよりは能率が低いが、測定可能な機器設定をすることが出来た。これを用いてニトロソアミンに関するDNA鎖切断作用、また一方、8ーメトキシソラレンと近紫外光によるin vitroならびにin vivoのDNAクロスリンクの形成の研究を行なった。
Nーニトロソジメチルアミン、Nーニトロソモルホリン、Nーニトロソプロリンを含む8種類のニトロソアミンを用いて超らせん環状2本鎖DNA(RFーI)の切断によるRFーII生成反応を追跡した。蛍光分析(エチディウムのインターカレイションを利用)と同時にゲル電気泳動も併用した。近紫外光(UVA)を照射するとDNA鎖切断が起こるが、照射しないときは全く切断が起こらなかった。また近紫外光照射のみでも切断は起こらなかった。光として、太陽光または蛍光ランプ光を用いても切断が起こった。これらの切断は光の照射量、ニトロソアミンの投与量に比例した。また切断はOHラジカルの捕捉剤であるギ酸やチオ尿素によって阻害された。またシステアミンも阻害効果があった。さらにスーパーオキサイドディスムターゼが切断を抑制した。これらの結果から。この切断は、ニトロソアミンと光の相互作用で生成した活性酸素種が原因であると推定された。
ショウジョウバエの幼虫に8ーメトキシソラレン(8MOP)を餌に混ぜて与え、同時にUVAを照射すると、成虫になった後の羽の毛に変異が現われた。この時、幼虫DNAに損傷、とくにクロスリンクが起こっているかどうかを調べた。幼虫DNAを抽出し、in vitroで8MOP+UVAで処理すると蛍光分析により顕著なクロスリンクが認められた。しかし、幼虫全体を8MOP+UVAで処理してからDNAを抽出して調べると、クロスリンクは検出できなかった。このことから、この変異はクロスリンク以外の傷が原因となっていると考えられた。
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