プレプロ構造を導入した酵素蛋白質の局在性とプロセシング

• 研究課題/領域番号: 01470120
• 研究種目: 一般研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 応用生物化学・栄養化学
• 研究機関: 筑波大学
• 研究代表者: 山根 國男 筑波大学, 生物科学系, 教授 (20013336)
• 研究期間 (年度): 1989 – 1990
• 研究課題ステータス: 完了 (1990年度)
• 配分額: 5,800千円 (直接経費: 5,800千円); 1990年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円); 1989年度: 4,500千円 (直接経費: 4,500千円)
• キーワード: 蛋白質プロセシング / 融合蛋白質 / 分泌生産 / 耐熱性αーアミラ-ゼ / Baillus subtilis / マチュレ-ション / アルカリ性プロテア-ゼ / 蛋白質のプロセシング / <Bacillus>___ー <subtilis>___ー / 枯草菌 / 蛋白質の分泌 / プロセシング / 人為的融合蛋白質 / プレプロ構造

研究概要

生物が生命活動を維持していくためにはタンパク質がその機能を正しく発現していることが必須である。それためには各々のタンパク質が機能する場所に輸送される局在化という段階と,それが活性化され,完成型タンパク質となるマチュレ-ションの段階を正しく受ける必要がある。
枯草菌をはじめとするグラム陽性菌の分泌蛋白質ではプロ構造を持った前駆体として培地中の分泌され,完成型となる酸素が多く知られており,プロ構造のプロセシングを解析するのに有効な系である。そこでグラム陽性菌の中で最も遺伝学的基礎研究が進んでいる枯草菌を材料としてそのプロセシングの機構を解析した。
枯草菌における分泌タンパク質のプロセシングやプロ構造が分泌に与える影響を解析するために枯草菌αーアミラ-ゼ・シグナルペプチドと完成型耐熱性αーアミラ-ゼの間に大腸菌プラスミドpBR322 DNA由来のペプチドを挿入した融合耐熱性αーアミラ-ゼを構築した。融合耐熱性αーアミラ-ゼを大腸菌および枯草菌に導入して発現させたところ,pBR322DNAに由来するペプチドの挿入によって、ほとんどの場合,酸素タンパク質の分泌量は低下した。しかし21アミノ酸からなるペプチドを挿入させたものでは,枯草菌の場合親株の約1.7倍の分泌生産量が増大した。これによりプロ構造の改良により分泌量を増大させ得る可能性が示された。枯草菌および大腸菌により分泌された耐熱性αーアミラ-ゼの分子量およびN未端付近のアミノ酸配列の解析の結果、大腸菌ではプロセシングを受けず前駆体として合成されるのに対し,枯草菌では正しくプロセシングされた完成型酸素として分泌されていた。枯草菌におけるプロセシングを調べるために大腸菌で合成した前駆体をinortro系で解析したところ、枯草菌のアルカリ性プロテア-ゼがプロセッシングの主要酸素として働いていることを明らかにすることができた。

研究成果

• [文献書誌] Nakamura. K., Fujita, T., Itoh, Y. and Yamano, K.: "Moclification of length,hydrophobic propenties and electroc change of Bacillus sultles αーamylaseaignel peptide and their different effects on the production of aecrefory proteins in B・suletilis and Eschenichia cob" Mol. Gen. Genet. 216. 1-9 (1989)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kimura, K., Kataoku, S., Nakamura, A., Takano, T., Kobayashi, S., and Yamane, K.: "Function of the COOH.terminal region of cycloclextrin ghrcano trausfenase of alkalophilor Bauillus sp. #104 : Relation to cotalizing acticity and pH stability" Biochem. Biophys. Res, Commun.161. 1273-1279 (1989)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Sasamoto, H., Nakasawa, K., Tsutsumi, K., Tahase, K., and Yamane, K.: "Signal pepticle of Bacillus subtilis αーamylase" J. Biochem.106. 376-382 (1989)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Itoh, Y., Kanoh, K., Nakamura, K., Takasa, K., and Yamada, K.: "Artificial insertion of peptides between signalpeptide and mcture protein : effect on secretion and proassing of hyprid therid thenmostable αーamylases in Bacillus subtilis and Escherichia cob ulls" J. Gen. Micrbiol. 136. 1551-1558 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Itoh, Y., Sumi, Nakamura, K., and Yamane, K.: "processing of an NH_2 terminally extended thernoshable αーamylase by Baciltuo subtilis protease" J. Biochem.108. 954-959 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Sadaie, Y., Takamatsu, H., Nakamura, K., ans Yamaue, K.: "Seuercing reoeals Somilarity of the wildーtype diot gene of Bacillus subtilis to the Escherichia coli seeA gere" Gene. (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Yamane, K.: "Bacilluo subtilin : Molecalar Biology and industrial application(ed. Maruo, B., and Yoshikawa, H.)Extraulluler engyass of B. subfilis" Elsevler Scionce Pulishens., 162-190 (1989)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Yanane, K., Itah, Y., Nakamura, K., Tsutsumi, K., and Takase, K.: "Genet. s and Biotechnology of Bacilli(ed. J. A. Hoch)Signal poptide cleauage and proussing of artificial extracellala hybrid αーamylaces in Bacillus subtilis" Academic Press Inc.,
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Nakamura, K., Fujita, K., Itoh, Y., and Yamane, K. :"Modification of length, hydrophobic properties, and electric chage of acillus subtilis alpha-amylase signal peptide and their different effects on the production of secretoty proteins in B. subtilis and Escherichia coli." Mol. Gen. Genet.216 ;. 1-9 (1989)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kimura, K., Kataoka, S., Nakamura, A., Takano, T., Kobayashi, S., and Yamane, K.: "Function of the COOH-terminal region of cyclodextrin glucanotransferase of alkalophilic Bacillus sp. #1011 : relation to catalyzing actevity a-d pH stability" Biochem. Biophys. Res. Commun.161 ;. 1273-1279 (1989)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Sasamoto, H., Nakazawa, K., Tsutsumi, K., Takase, K., and Tamane K.: "Signal peptide of Bacillus subtilis alpha-amylade." J. Biochem.,. 106 ;. 376-382 (1989)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Nakamura, J., Yamane, K., Yoda, K., and Yamasaki, M.: "Amplification of an Integration plasmid into the tmr amplification unit of a Bacillus subtilis tunicamycin-resistant mutant." Agric. Biol. Chem.53 ;. 19-24 (1989)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yamamoto, J., Shimizu, M., and Yamane, K. :"Nucleotide sequence of the diaminopimelate-de carboxylase gene from Bacillus subtilis" Nucleic Acids Res.17 ;. 10105 (1989)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yamane, K.: "Extracellular enzymes of B. subtilis." Bacillus subtilis : Molecular biology and industrial application. ed. by Maruo, B., and Yoshikawa, H.162-189 (1989)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Itoh, Y., Kanoh, K., Nakamura, K., Takase, K., and Yamane, K.: "Artificial insertion of peptides between signal pepetide and mature protein : effect on secretion and processing of hybrid thermostable alpha-amylases in Bacillus subtilis and Escherichia coli cells." J. Gen. Microbiol.,. 136 ;. 1551-1558 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Itoh, Y., Sumi, M., Nakamura, K., and Yamane, K.: "Processing of an NH_2-terminally extended thermostable alpha-amylase by Bacilus subtilis alkaline protease." J. Biochim.,. 108 ;. 954-959 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kimura, K., Ishii, Y., Kataoka, S., Takano, T., and Yamane, K.: "Expression of the beta-cyclodextrin glucanotransferase gene of an alkalophilic Bacillus sp. #1011 in Escherichia coli cells and characterization of the synthesized enzyme." Agric. Biol. Chem.54. 641-648 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Nakamura, K., Takamatsu, H., Nakamura, A., Yashikawa, H., and Yamane, K.: "Cloning and characterization of a Bacillus subtilis gene homologous to E. coli secY." J. Biochem.107 ;. 603-607 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Nakamura, K., Takamatsu, H., Akiyama, Y., Ito, K., and Yamane, K.: "Complementation of the protein transport defect of an Escherichia coli secY mutant (secY24) by Bacillus subtilis secY homologue." FEBS Letters. 273 ;. 75-78 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Sadaie, Y., Takamatsu, H., Nakamura, K., and Yamane, K.: "Sequencing reveals similarity of the wild type div gene of Bacillus subtilis to the Escherichia coli secA gene." Gene.
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Itoh,Y.,Kanoh,K.,Nakamura,K.,Takase,K.,and Yamane,K.: "Artificial insertion of peptides between signal peptide and mature protein:effect on secretion and processing of hybrid thermostable αーamylases in <Bacillus>___ー <subtilis>___ー and <Escherichia>___ー <coli>___ー cells." J.Gen.Microbiology. 136. 1551-1558 (1990)
• [文献書誌] Itoh,Y.,Sumi,M.,Nakamura,K.,and Yamane,K.: "Processing of an NH_2ーterminally extended thermostable αーamylase by <Bacillus>___ー <subtilin>___ー alkaline protease." J.Biohem.108. 954-959 (1990)
• [文献書誌] Kimura,K.,Ishii,Y.,Kataoka,S.,Takano,T.,and Yamane,K.: "Expression of the βーcyclodextrin glucanotransferase gene of an alkalophilic <Bacillus>___ー sp.#1011 in <Escherichia>___ー <coli>___ー cells and characterization of the synthesized enzyme." Agric.Biol.Chem.54. 641-648 (1990)
• [文献書誌] Nakamura,K.,Nakamura,A.,Takamatsu,H.,Yoshikawa,H.,and Yamane,K.: "cloning and Characterization of a <Bacillus>___ー <subtilis>___ー gene homologous to E__ー.<coli>___ー <secY>___ー." J.Biochem.107. 603-607 (1990)
• [文献書誌] Nakamura,K.,,Takamatsu,H.,Akiyama,Y.,Ito,K.,and Yamane,K.: "Complementation of the protein transport dafect of an <Escherichia>___ー <coli>___ー <secY>___ー mutant (<secY24>___ー) by <Bacillus>___ー <subtilis>___ー <secY>___ー homologue." FEBS Letters.273. 75-78 (1990)
• [文献書誌] Sadaie,Y.,Takamatsu,H.,Nakamura,K.,and Yamane,K.: "Sequencing reveals similarity of the wildーtype <dicet>___ー gene of <Bacillus>___ー <subtilis>___ー to the <Escherichia>___ー <coli>___ー <secA>___ー gene." Gene. (1991)
• [文献書誌] 山根 國男: "バイオサイエンス戦略マニュアル(瀬野悍二編)分担 細菌・ウィルス・プラスミド" 共立出版, 675-679 (1990)
• [文献書誌] Yamane,K.,Itoh,Y.,Nakamura,K.,Tsutsumi,K.,Takase,Y.: "Genetics and Biotechmology of Bacilli(ed.by J.A.Hoch) signal peptide cleavage and processing of artificial erctracellular hybrid αーamylases is <Bacillus>___ー <subtilis>___ー." Academic Press Inc.,
• [文献書誌] J.Nakamura,K.Yamane,K.Yoda and M.Yamasaki: "Amplification of an integration Plasmid intrduced into the tmrA amplification unit of a Bacillus subtilis tunicamycin-resistant mutant." Agric.Biol.Chem.53. 19-24 (1989)
• [文献書誌] K.Nakamura,Y.Fujita,Y.Itoh,and K.Yamane: "Modification of length,hydrophobic properties and electric charge of B.subtilis α-amylase signal peptide and their different effect on the production of secretory proteins in B.subtilis and E.coli cells." Mol.Gen.Genet.216. 1-9 (1989)
• [文献書誌] K.Kimura,S.Kataoka,A.Nakamura,T.Takano,S.Kobayshi,K.Yamane: "Function of the COOH-terminal region of cyclodextrin glucanotransferase of alkalophilic Bacillus sp.#1011:relation to catalyzing activity and pH Stability." Biochem.Biophys.Res.Commun.161. 1273-1279 (1989)
• [文献書誌] H.Sasamoto,K.Nakazawa,K.Tsutsumi,K.Yamane: "Singnal peptide of Bacillus subtilis α-amylase" J.Biochem. 106. 376-382 (1989)
• [文献書誌] J.Yamamoto,M.Shimizu,K.Yamane: "Nucleotide sequence of the diaminopimelate-decarboxylase gene from Bacillus subtilis" Nucleic Acids Res.17. 10105-10105 (1989)
• [文献書誌] K.Nakamura,A.Nakamura,H.Takamatsu,H.Yoshikawa,K.Yamane: "Cloning and characterization of a Bacillus subtilis gene homologous to E.coli secY." J.Biochem.
• [文献書誌] K.Kimura,Y.Ishii,S.Kataoka,T.Takano and K.Yamane: "Expression of the β-cyclodextrin glucanotransferase gene of an alkalophilic Bacillus sp.#1011 in Escherichia coli cells and characterization of the synthesized enzyme." Agric.Biol.Chem.54. 641-648 (1990)
• [文献書誌] 山根國男: "枯草菌のα-アミラ-ゼ" 微生物. 15. 48-60 (1989)
• [文献書誌] 山根國男: "DNAシ-ケンサ-" 植物細胞工学. 2. 61-68 (1990)
• [文献書誌] K.Yamane: "Extracellular enzymes of B.subtilis.Ed.by B.Maruo and H.Yoshikawa Bacillus subtilis molecular biology and industrial apprication" Elsevier, 162-189 (1989)
• [文献書誌] 山根國男: "枯草菌による有用蛋白質の分泌生産「特異な機能を有する微生物とその応用」バイオ高分子研究会編" 学会出版センタ-, 57-76 (1989)