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部位特異性突然変異法によるトランスアミナ-ゼ活性域の研究

研究課題

研究課題/領域番号 01480524
研究種目

一般研究(B)

配分区分補助金
研究分野 物質生物化学
研究機関大阪医科大学

研究代表者

鏡山 博行  大阪医科大学, 医学部, 教授 (80028555)

研究期間 (年度) 1989 – 1991
研究課題ステータス 完了 (1991年度)
配分額 *注記
6,500千円 (直接経費: 6,500千円)
1991年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
1990年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
1989年度: 4,400千円 (直接経費: 4,400千円)
キーワードトランスアミナ-ゼ / ピリドキサルリン酸 / 蛋白質工学 / 酵素反応機構 / アミノ基転移酵素 / 酵素活性中心 / 部位特異的突然変異 / 部位特異性突然変異 / アスパラギン酸アミノ基転移酵素 / ピリドキサル燐酸 / 活性中心 / 酵素の活性中心 / 基質認識
研究概要

立体構造についての情報が得られる大腸菌アスパラギン酸トランスアミナ-ゼに系統的なsiteーdirected mutagenesisを行った。変異酵素の大腸菌内大量生産系を確立し、精製変異酵素を用いて酵素化学的性質の変化を解析した。変異の対象は、大腸菌から高等動物の酵素にいたるまで共通に保存され、補酵素ピリドキサル燐酸(PLP)や基質である酸性アミノ酸と相互作用している残基を選び、それらの役割を調べた。
基質アミノ酸のαーHの引き抜きという段階が律速段階である。それを行う残基の第一候補と考えられていたLys258の変異酵素をつくり反応動力学や吸収スペクトルの解析を行ってそれを証明した。Asp222変異体の解析からは222位に負電荷が必要なこと、Tyr225変異体の解析からは、225位とPLPの3′ー0^ーの間の水素結合が必要で、この2つの残基が協同で働くことにより、PLPが基質のαーCの周辺から電子を引っ張り、αーHを解離しやすくすることによって触媒効率を上げていることを知った。基質ジカルボン酸の認識にあずかっているArg292や386はLysでは代用されないこと、292位を中性アミノ酸に置換するとジカルボン酸は結合しなくなり、中性アミノ酸に対する反応性が増大することがわかり、基質認識過程での292位の重要性が浮かび上がった。従来より反応過程に必須の働きをすると考えられてきたTrp140は、触媒反応そのものには必須ではなく、ジカルボン酸の認識に働いていること、Tyr70が炭素数4つのAspの認識には関係しないが、炭素数5つのGluの認識に関わっていることを明らかにした。
このような解析を通じて、本酵素の示す基質特異性や効率的な触媒反応を与えている分子設計を垣間見ることができた。

報告書

(4件)
  • 1991 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 1990 実績報告書
  • 1989 実績報告書
  • 研究成果

    (59件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (59件)

  • [文献書誌] Nagashima,F.: "cDNA Cloning and Expression of Pig Cytosolic Aspartate Aminotransferase in Escherichia coli:Aminoterminal Heterogeneity of Expressed Products and Lack of Its Correlation with Enzyme Function." Biochemistry. 28. 1153-1160 (1989)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tanizawa,K.: "The Primary Structure of Thermostable D-Amino Acid Aminotransferase from A Thermophilic Bacillus Species,and Its Correlation with L-Amino Acid Aminotransferase." J.Biol.Chem.264. 2450-2454 (1989)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Inoue,Y.: "Substitution of A Lysyl Residue for Arginine386 of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase." J.Biol.Chem.9673-9681 (1989)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hayashi,H.: "〔Arg292--Val〕or 〔Arg292--Leu〕 Mutation Enhances The Reactivity of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase with Aromatic Amino Acids." Biochem.Biophys.REs.Commun.159. 337-342 (1989)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] kamitori,S.: "Crystallization and Preliminary X-Ray Characterization of Branched-Chain Amino acid Aminotransferase From Escherichia coli." J.Biochem.105. 671-672 (1989)

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  • [文献書誌] 倉光 成紀: "Siteーdirected mutagenesisによるタンパク質機能の解析" 臨床科学. 25. 249-259 (1989)

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  • [文献書誌] 林 秀行: "アミノ酸転移酵素研究の新展開(蛋白質化学から蛋白質工学へ)" 蛋白質 核酸 酵素. 34. 1893-1903 (1989)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hayashi,H.: "Effect of Replacement of Tryptophan-140 by Phenylalanine or Glycine on The Function of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase." Biochem.,Biophys.Rse.Commun.167. 407-412 (1990)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Sung,M-H.: "Purification and Characterization of Thermostable Aspartate Aminotransferase From A Thermophilic Bacillus Species." J.Bacteriol.172. 1345-1351 (1990)

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  • [文献書誌] Kuramitsu,S.: "Pre-Steady State Kinetics of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase Catalyzed Reactions and Thermodynamic Aspects of Its Sustrate Specificty." Biochemistry. 29. 5469-5476 (1990)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Morino,Y.: "Mammalian Aspartate Aminotransferase Isozymes:From DNA to Protein." Annals of The New York Academy of Sciences. 585. 32-47 (1990)

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  • [文献書誌] Kamitori,S.: "Three-Dimensional Structures of Aspartate Aminotransferase Form Escherichia coli and Its Mutant Enzyme at 2.5A Resolution." J.Biochem.108. 175-184 (1990)

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  • [文献書誌] 倉光 成紀: "アスパラギン酸トランスアミナ-ゼ" プロテインエンジニアリング(現代化学). 増刊19. 64-73 (1990)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Sung,M-H.: "Thermostable Aspartate Aminotransferase From A Thermophilic Bacillus species:Gene Cloning,Sequence Determination,and preliminary X-Ray Characterization." J.Biol.Chem.266. 2567-2572 (1991)

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  • [文献書誌] Inoue,K.: "Tyr225 in Aspartate Aminotransferase:Contribution of The Hydrogen Bond Between Tyr225 and Coenzyme to The Catalytic Reaction." J.Biochem.109. 570-576 (1991)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hayashi,H.: "Replacement of An Interdomain Residue Va139 Escherichia coli Aspartate aminotransferase Affects The Catalytic Copetence Without Altering the Substrate Specificity of The Enzyme." J.Biochem.109. 699-704 (1991)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Yano,T.: "The Rolr of His143 in The Catalytic Mechanism of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase." J.Biol.Chem.266. 6079-6085 (1991)

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  • [文献書誌] Inoue,K.: "Site-Directed Mutagenesis of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase:Role of Tyr70 in The Catalytic Process." Biochemistry. 30. 7796-7801 (1991)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Sung,M-H.: "Molecular Cloning and Sequence Determination of Thermostable aspartate Aminotransferase From Thermophilic Bacillus Species." Enzymes Dependent on Pyridoxal Phosphate and Other Carbonyl Compounds as Cofactors.(Fukui,T.et al.eds.). 55-57 (1991)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Okamota,A.: "Three-Dimensional Structure of Aspartate Aminotransferase Form Escherichia coli." Enzymes Dependent on Pyridoxal Phosphate and Other Carbonyl Compounds as Cofactors.(Fukui,T.et al eds.). 107-109 (1991)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kuramitsu,S.: "Asp222,His143,and Tyr70 in Escherichia coli Aspartate Aminotransferase." Enzymes Dependent on Pyridoxal Phosphate and Other Carbonyl Compounds as Cofactors.(Fukui,T.et al eds.). 179-181 (1991)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hayashi,H.: "Escherichi coli Aspartate Aminotransferase:Effect of Site-Specific Mutations on Substrate Binding and Catalysis." Enzymes Dependent on Pyridoxal Phosphate and Other Carbonyl Compounds as Cofactors.(Fukui,T.et al eds.). 183-186 (1991)

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  • [文献書誌] 倉光 成紀: "ピリドキサル酵素の蛋白工学" 蛋白工学シリ-ズ蛋白質立体構造の新しい視点(森川耿右編). 152-173 (1991)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Nagashima, F.: "cDNA Cloning and Expression of Pig Cytosolic Aspartate Amino-transferease in Escherichia coli : Aminoterminal Heterogeneity of Expressed Products and Lack of Its Correlation with Enzyme Function." Biochemistry. 28. 1153-1160 (1989)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tanizawa, K.: "The Primary Structure of Thermostable D-Amino Acid Aminotransferase from A Thermophilic Bacillus Species, and Its Correlation with L-Amino Acid Aminotransferase." J. Biol. Chem.264. 2450-2454 (1989)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Inoue, Y.: "Substitution of A Lysyl Residue for Arginine386 of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase." J. Biol. Chem.9673-9681 (1989)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hayashi, H.: "[Arg292--Val] or [Arg292--Leu] Mutation Enhances The Reactivity of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase with Aromatic Amino Acids." Biochem. Biophys. Res. Commun.159. 337-342 (1989)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kamitori, S.: "Crystallization and Preliminary X-Ray Characterization of Branched-Chain Amino acid Aminotransferase From Escherichia coli." J. Biochem.105. 671-672 (1989)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hayashi, H.: "Effect of Replacement of Tryptophan-140 by Phenylalanine or Glycine on The Function of Escherichia coli Aspartate Aminotrans-ferase." Biochem., Biophys. Rse. Commun.167. 407-412 (1990)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Sung, M-H.: "Purification and Characterization of Thermostable Aspartata Aminotransferase From A Thermophilec Bacillus Species." J. Bacteriol.172. 1345-1351 (1990)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kuramitsu, S.: "Pre-Steady State Kinetics of Escherichia coli Aspartate Amino-transferase Catalyzed Reactions and Thermodynamic aspects of Its Sustrate Specificty." Biochmeistry. 29. 5469-5476 (1990)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Morino, Y.: "Mammalian Aspartate Aminotransferase Isozymes : From DNA to Protein." Annals of The Nwe York Academy of Sciences. 585. 32-47 (1990)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kamitori, S.: "Three-Dimensional Structures of Aspartate Aminotransferase From Escherichia coli and Its Mutant Enzyme at 2.5A Resolution." J. Biochem.108. 175-184 (1990)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Sung, M-H.: "Thermostable Aspartate Aminotransferase From A Thermophilic Bacillus Species : Gene Cloning, Sequence Determination, and Preliminary X-Ray Characterization." J. Biol. Chem.266. 2567-2572 (1991)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Inoue, K.: "Tyr225 in Aspartate Aminotransferase : Contribution of The Hydrogen Bond Between Tyr225 and Coenzyme to The Catalytic Reaction." J. Biochem.109. 570-576 (1991)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hayashi, H.: "Replacement of An Interdomain Residue Va139 of Escherichia coli Aspartate aminotransferase Affects The Catalytic Competence With-out Altering the Substrate Specificity of The Enzyme." J. Biochem.109. 699-704 (1991)

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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Yano, T.: "The Rolr of His143 in The Catalytic Mechanism of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase." J. Biol. Chem.266. 6079-6085 (1991)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Inoue, K.: "Site-Directed Mutagenesis of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase : Role of Tyr70 in The Catalytic Process." Biochemistry. 30. 7796-7801 (1991)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Sung, M-H.: "Molecular Cloning and Sequence Determination of Thermostable aspartate Aminotransferase From Thermophilic Bacillus Species." Enzymes Dependent on Pyridoxal Phosphate and Other Carbonyl Compounds as Cofactors.(Fukui, T. et al. eds.). 55-57 (1991)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Okamota, A.: "Three-Dimensional Structure of Aspartate Aminotransferase From Escherichia coli." Enzymes Dependent on Pyridoxal Phosphate and Other Carbonyl Compounds as Cofactors.(Fukui, T. et al. eds.). 107-109 (1991)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Kuramitsu, S.: "Asp222, His143, and Tyr70 in Escherichia coli Aspartate Amino-transferase." Enzymes Dependent on Pyridoxal Phosphate and Other Carbonyl Compounds as Cofactors.(Fukui, T. et al. eds.). 179-181 (1991)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
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      1991 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hayashi, H.: "Escherichi coli Aspartate Aminotransferase : Effect of Site-Specific Mutations on Substrate Binding and Catalysis." Enzymes Dependent on Pyridoxal Phosphate and Other Carbonyl Compounds as Cofactors.(Fukui, T. et al. eds.). 183-186 (1991)

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  • [文献書誌] Moon-Hee Sung: "Thermostable Aspartate Aminotransferase from a Thermophilic Bacillus Species:Gene Cloning,Sequence Determination,and Preliminary X-Ray Characterization" J.Biol.Chem.266. 2567-2572 (1991)

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  • [文献書誌] Katsura Inoue: "Tyrosine 225 in Aspartate Aminotransferase:Contribution of the Hydrogen Bond Between Tyr 225 and Coenzyme to the Catalytic Reaction" J.Biochem.109. 570-576 (1991)

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      1991 実績報告書
  • [文献書誌] Hideyuki Hayashi: "Replacement of an Interdomain Residue Vol39 of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase Affects the Catalytic Competence without Altering the Substrate Specificity of the Enzyme" J.Biochem.109. 699-704 (1991)

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  • [文献書誌] Takato Yano: "The Role of His^<143> in the Catalytic Mechanism of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase" J.Biol.Chem.266. 6079-6085 (1991)

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  • [文献書誌] Katsura Inoue: "Site-Directed Mutagenesis of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase:Role of Tyr70 in the Cataly tic Process" Biochemistry. 30. 7796-7801 (1991)

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  • [文献書誌] Seiki Kuramitsu: "Preーsteady state kinetics of Escherichia coli aspartate aminotransferase catalyzed reactions and thermodynamic aspects of its substrate specificiry" Biochemistrg. 29. 5469-5476 (1990)

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      1990 実績報告書
  • [文献書誌] Yoshimasa Morino: "Mammalian aspartote aminotrausferase isozywes:fron DNA to protein" Ann.New York Acad.Sci.585. 32-47 (1990)

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  • [文献書誌] Shigehiro Kamifori: "Three dimensional structures of aspartate aminotrausferase from Escherichia coli and its mutaut euzymu at 2.5A^^゚ resolution" J.Biochem.108. 175-184 (1990)

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  • [文献書誌] Katsura Inoue: "SiteーDirected Mutagenesis of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase:Role of Tyr70 in the catalytic Proess" J.Biochem. (1991)

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  • [文献書誌] Hideyuki Hayashi: "〔Arg292→Val〕or〔Arg292→Leu〕Mutation Enhances The Reactivity of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase with Aromatic Amoni Acids" Biochem.Biophys.Res.Commun.151. 337-342 (1989)

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  • [文献書誌] Shigehiko Kamitori: "Crystallization and Preliminary X-Ray Characterization of Branched-Chain Amino Acid Aminotransferase From Escherichia Coli" J.Biochem.105. 671-672 (1989)

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  • [文献書誌] Yasushi Inoue: "Substitution of A hysyl Residue For Arg386 of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase" J.Biol.Chem.264. 9673-9681 (1989)

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  • [文献書誌] Fujio Nagashima: "cDNA Cloning and Expression of Pig Cytosolic Aspartade Aminotransferase in Escherichia coli:Amino Terminal Heterogeueity of Expressed Products And Lack of Its Correlatiun with Enzyme Function" Biochemistry. 28. 1153-1160 (1989)

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  • [文献書誌] Katsuyuki Tanizawa: "The Primary Structure of Thermostable D-Amino Acid Aminotransferase From a Thermophilic Bacillus Species,And Its Correlation with 1-Amino Acid Anminotransferarse" J.Biol.Chem.264. 2450-2454 (1989)

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  • [文献書誌] Seiki Kuramitsu: "Presteady State Kinetics of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase-Catalyzed Reactions And Thermoslynamic Aspect of Its Substrate Specificity" Biochemistry. (1990)

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      1989 実績報告書

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公開日: 1989-04-01   更新日: 2016-04-21  

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