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サブユニット間相互作用の強化によるグルコ-ス脱水素酵素の耐熱化

研究課題

研究課題/領域番号 01550762
研究種目

一般研究(C)

配分区分補助金
研究分野 発酵工学
研究機関大阪大学

研究代表者

卜部 格  大阪大学, 工学部, 助教授 (60029246)

研究分担者 岡田 弘輔  大阪大学, 工学部, 教授 (20028947)
研究期間 (年度) 1989 – 1990
研究課題ステータス 完了 (1990年度)
配分額 *注記
1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
1990年度: 300千円 (直接経費: 300千円)
1989年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
キーワードグルコ-ス脱水素酵素 / 熱安定化 / 人工突然変異 / サブユニット間相互作用 / アミノ酸置換 / 耐熱化変異
研究概要

グルコ-ス脱水素酵素遺伝子を変異処理し,大腸菌内で変異型酵素を生産させた。50mMリン酸緩衝液(pH6.5)中で、60^0C、20分間熱処理し、酵素活性を持つクロ-ンを選択した。野生型酵素は、熱処理をする緩衝液中に2M塩化ナトリウムが存在すると、前述の熱処理で失活しないが、塩化ナトリウムを添加しない条件下では完全に失活する。スクリ-ニングの結果、12株の陽性クロ-ンが得られた。粗酵素液を調整して、pH6.5での熱安定性を検討したところ、50^0C以上で、得られたすべての変異型酵素は、野生型酵素よりも安定であった。
得られた変異型酵素は1から4のアミノ酸置換を持っていた。そのうち、4つの酸素で1アミノ酸置換が認められ、置換の生じた位置は、96番目のGlu、252番目のGlnおよび253番目のTyrで、これら3つのアミノ酸置換はグルコ-ス脱水素酵素の安定性に関与していると思われた。
変異型酵素の安定化とアミノ酸置換との関係について調べるため、1アミノ酸置換を持つ4つの変異型酵素(E96A,E96G,Q251L,Y253C)を精製し、変異型酵素の性質について検討した。
精製した4つの変異型酵素、並びに野生型酵素のpH6.5での熱安定性を比較したところY253C,Q252L,E96G,E96Aの順に高くなっていた。特に、E96Aでは野生型酵素よりも約20^0Cも安定性が増していた。
変異型酵素のpH安定性を調べたところ、アルカリ溶液中で、程度の差はあるものの、いずれの酵素も野生型酵素よりも安定であったことから、これらの変異型酵素では、各アミノ酸置換により、サブユニット間相互作用が強化され、サブユニット構造が安定化していると結論した。したがって、1アミノ酸置換が生じていた3つのアミノ酸残基は、サブユニット境界面に存在する可能性が高いと思われる。

報告書

(3件)
  • 1990 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 1989 実績報告書

研究成果

(9件)

すべて その他

すべて 文献書誌

  • [文献書誌] Y.Makino: "Stabilityーincreasing Mutants of Glucose Dehydrogenase from <Bacillus>___ー <megaterium>___ー IWG3" J.Biol.Chem.264. 6381-6385 (1989)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1990 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] T.Nagao: "Stabilityーincreasing mutants of glucose dehydrogenase" FEBS Letters. 253. 113-116 (1989)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1990 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] K.Yamamoto: "Characterization of Mutant Glucose Dehydrogenase with Increasing Stability" Enzyme Engineering 10,Ann.N.Y.Acad.Sci.613. 362-365 (1990)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      1990 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Yasutaka Makino: "Stability-increasing Mutants of Glucose Dehydrogenase from Bacillus megaterium IWG3" J. Biol. Chem.264. 6381-6385 (1989)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1990 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Toshihiro Nagao: "Stability-increasing mutants of glucose dehydrogenase" FEBS Letters. 253. 113-116 (1989)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1990 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Keizo Yamamoto: "Characterization of Mutant Glucose Dehydrogenase with Increasing Stability" Enzyme Engineering 10, Ann. N. Y. Acad. Sci.613. 362-365 (1990)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      1990 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] K.Yamamoto: "Characterization of Mutant Glucose Dehydrogenase with Increasing Stability" Enzyme Engineering 10,Ann.N.Y.Acad.Sci.613. 362-365 (1990)

    • 関連する報告書
      1990 実績報告書
  • [文献書誌] Toshihiro Nagano: "Stabilityーincreasing mutants of glucose dehydrogenase" FEBS LETTERS. 253. 113-116 (1989)

    • 関連する報告書
      1989 実績報告書
  • [文献書誌] Yasutaka Makino: "Stabilityーincreasing Mutants of Glucose Dehydrogenase from Bacillus megaterium IWG3" The Journal of Biological Chemistry. 264. 6381-6385 (1989)

    • 関連する報告書
      1989 実績報告書

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公開日: 1989-03-31   更新日: 2016-04-21  

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