| 研究課題/領域番号 |
01570045
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
生理学一般
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
今井 清博 大阪大学, 医学部, 助教授 (50028528)
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| 研究分担者 |
石森 浩一郎 京都大学, 工学部, 助手 (20192487)
宮崎 源太郎 大阪大学, 基礎工学部, 教務職員 (50166146)
渡邉 学 (渡邊 学) 大阪大学, 医学部, 助手 (30182950)
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| 研究期間 (年度) |
1989 – 1990
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| 研究課題ステータス |
完了 (1990年度)
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| 配分額 *注記 |
2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
1990年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
1989年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
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| キーワード | 人工変異体 / ヘモグロビン / 部位特異的変異導入 / タンパク質工学 / アミノ酸置換 / 組換えDNA / アロステリック効果 / ヘモグトビン / 部位指定変異導入 |
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| 研究概要 |
組換えDNAを用いた部位特異的変異導入法によって、特定のアミノ酸の置換を有する人工変異ヘモグロビンを大腸菌を使って合成し、それらの酸素結合機能、光吸収スペクトル、プロトン核磁気共鳴(NMR)スペクトル、共鳴ラマン散乱などを測定することによって、へモグロビンのアステリック生理機能発現にとって鍵となるアミノ酸残基の役割を実験的に検証した。
合成した変異へモグロビンは、β鎖内の三次構造の変化を引き起こす役割を果たすと考えられているTyrー145βをPheに置換したHb Y145βF、α1ーβ2界面にあって、T状態でAspー94αと水素結合を形成し、T状態を安定化するTrpー37βをPheに置換したHb W37βF、ヘム鉄の第五配位子の座を占める近位His(92β)をValまたはAspで置換したHb H92βV、Hb H92βDの合計4種である。グロビン遺伝子への変異導入、グロビン遺伝子の発現には、M13ファ-ジ・大腸菌の系を用いた。
Hb Y145βFの酸素結合機能の変化(酸素親和性、Bohr効果、協同効果、イノシトル六燐酸の効果)は比較的おだやかであったが、Hb W37βFのそれは著明であった。紫外域光吸収、NMR、共鳴ラマンスペクトルなどによる高次構造のデ-タは、概ね機能変化のデ-タと一致した。その結果、Tryー145βの役割としては、Aspー94βと水素結合を形成することよりも、それのフェノ-ル基がチロシンポケットに収まる大きさを持つことが重要であること、Hb w37βFの機能変化は、二量体への部分的解離による可能性が指摘された。
Hb H92βV、Hb H92βDの機能変化も著明であった。近位Hisを中性または陰性荷電の残基で置換すると、アロステリック効果がほぼ消失するが、M型Hbとは異なり、変異鎖のヘム鉄を2価の状態に維持することができた。
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