| 研究課題/領域番号 |
01570134
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
医化学一般
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
筒井 研 岡山大学, 医学部, 助教授 (70108158)
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| 研究分担者 |
関 周司 岡山大学, 医学部, 教授 (50032884)
保田 立二 岡山大学, 医学部, 教授 (30092357)
渡来 仁 岡山大学, 医学部, 助手 (50175139)
筒井 公子 岡山大学, 医学部, 助手 (70144748)
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| 研究期間 (年度) |
1989 – 1990
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| 研究課題ステータス |
完了 (1990年度)
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| 配分額 *注記 |
2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
1990年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
1989年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
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| キーワード | 核骨格 / 超らせんDNA / RNA転写 / DNA結合タンパク質 / 核マトリックス / DNA結合蛋白質 |
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| 研究概要 |
1.DNAル-プの超らせん構造は核骨格への付着によって維持されているが、付着のメカニズムについてはよくわかっていない。我々は核骨格付着領域DNAと特異的に結合する、従ってDNAの付着を媒介すると考えられる分子量120kDaの核骨格蛋白質を同定した。この蛋白質とDNAの相互作用を更に詳細に調べるためcDNAのクロ-ニングを試みた。ラット脳の核骨格から精製した120K蛋白質のCNBr断片のN末端アミノ酸配列を決定し、これに基づき混合オリゴヌクレオチド・プライマ-を合成し、ラット脳の全RNAを鋳型としたRTーPCRを行った。反応産物をクロ-ニングし、約1kbのcDNA断片が挿入されたクロ-ンを得た。
2.ビオチン標識した超らせんDNAを用いて、核骨格の超らせんDNA結合部位を構成する核骨格蛋白質と思われる75kDaの超らせんDNA結合蛋白質を同定した。この蛋白質の転写反応に対する影響を調べるため、核骨格からの可溶化と精製を行った。75K蛋白質は核骨格画分に存在するが、分離核を直接低イオン強度下に高濃度のethidium bromideで処理すると選択的に遊離された。超らせんDNA結合活性を指標としてイオン交換(Mono Q)とゲルろ過カラム(G3000SWxl)で分画することによりほぼ均一な75K蛋白質が得られた。この蛋白質はゲルろ過では分子量約380Kとして挙動し、自己会合体を形成していると考えられた。
3.ヒト細胞には異なる遺伝子にコ-ドされた少なくとも2種類(αとβ)のDNAトポイソメラ-ゼII(トポII)が存在する。我々はトポIIβとRNA合成の関連を調べるため、ラットのトポIIのcDNAクロ-ニングを行った。ハエとヒトのトポIIのアミノ酸配列を比べ、よく保存された領域に対応する混合オリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマ-としたDNA増幅反応(RTーPCR)によりラット脳で発現しているトポIIのcDNAクロ-ンを得た。これらのクロ-ンは制限酵素パタ-ンの違いから2群に分類され、塩基配列を決定したところ、それぞれヒトのトポIIαとβに高い相同性を示した(アミノ酸レベルでそれぞれ95%および98%)。
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