| 研究課題/領域番号 |
01570145
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
医化学一般
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| 研究機関 | (財)大阪バイオサイエンス研究所 |
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研究代表者 |
渡部 紀久子 (渡辺 紀久子) (財)大阪バイオサイエンス研究所, 第2研究部, 研究員 (90211672)
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| 研究分担者 |
陳 蘭英 (財)大阪バイオサイエンス研究所, 第2研究部, STAフェロー
KUCHINKE Wol (財)大阪バイオサイエンス研究所, 第2研究部, STAフェロー
早石 修 (財)バイオサイエンス研究所, 所長 (40025507)
CHEN Lan-Ying Osaka Bioscience Institute, 2nd Dept., STA Fellow
KUCHINKE Welfgang Osaka Bioscience Institute, 2nd Dept., STA Fellow
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| 研究期間 (年度) |
1989 – 1991
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| 研究課題ステータス |
完了 (1991年度)
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| 配分額 *注記 |
2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
1991年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
1990年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
1989年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
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| キーワード | プロスタグランジン / PGF合成酵素 / 9α,11βーPGF_2 / アイソザイム / PGF2α / PGF_2α / 光親和ラベル / PGD還元活性 / 多機能酵素 / 活性部位 / 構造 / 9α・11βーPGF_2 / アルド・ケト還元酵素 / クリスタリン |
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| 研究概要 |
プロスタグランジン(PG)F合成酵素は、363個のアミノ酸よりなる分子量36、666の単一鎖の単純蛋白質であり、NADPH存在下に異なる二つの活性部位でPGH_2からPGF_2αを、PGD_2から9α,11βーPGF_2を生成する酵素である。平成元年度から3年度の研究期間においてPGF合成酵素に少なくとも肺型と肝臓型のアイソザイムが存在することが明らかとなり両アイソザイムについての研究を行った。
肺型PGF合成酵素
1.PGF合成酵素と一次構造において高い相似性のあるρークリスタリンは、1%以下という極めて低いPGF合成酵素活性しか示さず、ρークリスタリンにおいて活性部位の変化が示唆された。
2.1.の結果およびPGF合成酵素と遺伝子群を作っているアルド・ケト還元酵素群の酵素、ρークリスタリンの一次構造を比較した結果、酵素群の ^<195>ProがρークリスタリンではVAlに変化していることに注目してPGF合成酵素のcDNAを用いて ^<195>Proの部位特異的変異を行った。その結果、PGD_2還元活性が低下し、このアミノ酸がPGD_2の生活部位に関与していることが示唆された。
3.トリプシンおよびV8プロテ-スで限定分解を行った結果、 ^<127>Lysおよび ^<133>Gluで切断され本酵素は二つのペプチドに分離した。この結果、これらのアミノ酸が立体構造上蛋白の表面に位置していることが示唆された。
4.PGD_2の誘導体を化学合成し、PGF合成酵素を光親和ラベルし、PGD_2の活性部位に関与する三アミノ酸を決定した。
5.遺伝子操作を用いてPGF合成酵素のC末端側より削減を行った結果、C末端側の数アミノ酸がPGD_2還元活性に重要な役割を果たしていることが確認された。
肝臓型PGF合成酵素
1.肺型PGF合成酵素の抗体を用いてウシの臓器分布を調べた結果、肝臓に本抗体と約80%交差する肺型とは異なる酵素が存在することが明らかとなった。ウシ肝臓より本酵素を均一にまで精製した結果、PGD_2に対するKm値が10μMと肺型の12μMより低く、また塩素イオンや金属イオンに対する影響も異なることが判明した。
2.肺型PGF合成酵素のcDNAを用いて肝臓のcDNAライブラリ-よりPGF合成酵素のクロ-ンを単離した結果、肝臓にも肺PGF合成酵素の一次構造とわずか3アミノ酸が異なる肺型の酵素が存在することが明らかとなった。
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