| 研究概要 |
前年度の研究で筆者は大腸菌RNaseHの光親和性標識を行うために、光活性型RNA・DNAハイブリドすなわちDNA鎖の5'末端にフェニルジアジリン誘導体が結合した基質を合成した。デオキシ鎖の配列は5'ーGTCATCTCCー3'あるいは5'ーG欠質体である。これらハイブリドとRNaseHの混合物をOﾟCで長波長uv照射するとクロスリンキングが認められた。今年度は上の配列のいづれかの丁をウリジン誘導体(2'位に種々の型のアミノリンカ-が結合)に置換したものを合成し、さらに末端アミノ基にジアジリン誘導体を導入した。これらのRNAハイブリドはRNaseHの基質となることがわかった。RNAハイブリド(DNAは5'ー^<32>Pラベル体)と酵素との光反応を行うと、クロスリンク体の収率は1〜3%であった。なお本反応は基質の切断が起こらないようにEDTAを加えているが、この条件でも未照射混合物はゲル電気泳動の分析により酵素・基質複合体を形成することが確認された。またこの光親和性標識は阻害実験の結果から、基質結合部位に特異的であると考えられた。光反応後、陽イオン交換クロマトラフィ-により未反応酵素と標識酵素を分離することができた。なお後者には核酸が混在しており、この分離にはゲル〓過が有効であったが、標識酵素の単離には至っていない。上の標識酵素混合物をリシルエンドペプチダ-ゼで消化し得られたペプチドマップをRNaseHのものと比較検討した。各種DNAハイブリドによる標識体の結果をまとめると、減少ペプチドはLEP2,3,4であることが判明した。RNaseHの触媒活性部位は10Asp,48Gklu,70Aspであることが蛋白工学手法で明らかにされており、これらの残基は上記ペプチド断片中にある。このように本研究ではLEP2,3,4がRNsaeH基質結合部位を形成していることが明らかにできた。
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