| 研究課題/領域番号 |
01571214
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
生物系薬学
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
山田 秀徳 九州大学, 薬学部, 助手 (80037613)
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| 研究分担者 |
植田 正 九州大学, 薬学部, 助手 (90184928)
井本 泰治 九州大学, 薬学部, 教授 (90038282)
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| 研究期間 (年度) |
1989 – 1990
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| 研究課題ステータス |
完了 (1990年度)
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| 配分額 *注記 |
2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
1990年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
1989年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
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| キーワード | 遺伝子工学 / ニワトリリゾチ-ム / 大腸菌 / N末端プロセッシング / デアミデ-ション / 巻戻し / フォルディング / SS-SH交換反応 / 変異リゾチ-ム |
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| 研究概要 |
遺伝子工学を利用して、大腸菌にジスルフィド結合を有する外来性蛋白質を生産させると、いわゆるインクル-ジョンボディ-となり不溶化することが多く、これが大腸菌の発現系の価値を著しく減少させている。そこで、大腸菌による外来蛋白質の生産系の有用性を高める目的で、大腸菌に変異ニワトリリゾチ-ム生産させ、不溶化したリゾチ-ムの可溶化、純度、N末端のプロセッシング及び巻戻し条件を検討し、以下の結果を得た。1.大腸菌に生産させたリゾチ-ムには、脱アミド化を受けたものが大量に含まれていた。2.N末端にMetが付加したリゾチ-ムでは、4個以上脱アミド化されたもの(約50%)は10%酢酸では抽出されなかった。3.抽出したリゾチ-ムをグルタチオンの酸化還元系で還元状態から巻戻すと、約25%しか巻戻らず、2個以上脱アミド化されたリゾチ-ムは沈澱して巻戻らないことがわかった。4.脱アミド化を受けたものを除いた場合、このリゾチ-ムの巻戻り率は50%であった。5.新たに開発したSH基の可逆的修飾試薬で、変性リゾチ-ムを可溶化し、カテプシンC消化を行なうことにより、リゾチ-ムのN末端を天然型にプロセスすることに成功した。6.N末端のMetを除去したリゾチ-ムの巻戻り率は80%に達した。7.N末端のMetとAla31→Valの2重に変異を持つリゾチ-ムは通常の巻戻し条件では全く巻き戻らかったが、巻戻し系に1M尿素を加えると、この変異リゾチ-ムも10%程度巻戻った。以上の結果より、脱アミド化や、疎水性アミノ酸のN末端への付加、あるいは疎水度を上昇させるような内部の変異は、いずれも変性リゾチ-ムの溶解度を減少させるために、巻戻り率を低下させると結論した。したがって、大腸菌による外来性蛋白質の生産系の有用性を高めるためには、N末端のプロセッシング法の開発に加えて、デアミデ-ス欠損大腸菌株を利用することが必要である。
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