| 研究課題/領域番号 |
01580190
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
代謝生物化学
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
山田 道之 大阪大学, たんぱく質研究所, 助教授 (10076995)
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| 研究期間 (年度) |
1989 – 1990
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| 研究課題ステータス |
完了 (1990年度)
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| 配分額 *注記 |
2,400千円 (直接経費: 2,400千円)
1990年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
1989年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
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| キーワード | ミエロトペルオキシダ-ゼ / 遺伝子発現の調節 / 遺伝子導入 / 転写調節領域 / ミエロペルオキシダ-ゼ |
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| 研究概要 |
ミエロペルオキシダ-ゼ(MPO)は顆粒球に特異的なヘムタンパク質であり、顆粒球発生の初期に合成され、成熟細胞ではもはや合成されていない。MPOは、培養HLー60細胞においても合成されているが、レチノイン酸によるHLー60細胞の成熟顆粒球への分化誘導によって、またホルボルエステルTPAによるマクロファ-ジへの分化誘導によって合成されなくなる。このMPO合成のダウン調節は転写レベルで行われているが、その詳細は不明である。本研究の目的は、すでにクロ-ニングされているMPO遺伝子クロ-ンλMPO18とλMPO14を用いて遺伝子の発現調節領域を解明することであった。
λMPO18は遺伝子5'上流域を含み、λMPO14は遺伝子3'下流域を含み、両者でMPO遺伝子約17kbpを含む。これらのクロ-ンの遺伝子DNAを制限酵素で消化し、制限酵素断片を分離し、エンハンサ-依存性発現ベクタ-(SV40初期プロモ-タ-ークロラムフェニコ-ルアセチルトランスフェラ-ゼ(CAT)遺伝子ベクタ-)に挿入し、組み換えプラスミドを得た。これらのプラスミドをMPO産生HLー60細胞に導入し、CAT活性を定量することによりMPO遺伝子のエンハンサ-活性を測定した。遺伝子導入はリン酸カルシュウム法やDEAEーデキストラン法では不可能であり、電気穿孔法によって初めて可能となった。CATアッセイの結果、3個の制限酵素断片に弱いエンハンサ-活性が検出された。そこで、これらのDNA断片の塩基配列を決定した。検索によって、これらの塩基配列のエンハンサ-に既知の配列が含まれていることが判明した。このDNA断片を ^<32>Pで標識し、HLー60細胞核抽出液を用いてゲルシフトアッセイを行ったところ、DNAのタンパク質への結合が認められた。さらに、DNaseIフットプリンティング法によってタンバク質結合領域の決定を試みたが、明確に決定できなかった。
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