RNA依存性RNA合成酵素を用いた自己複製系の構築

• 研究課題/領域番号: 01F00514
• 研究種目: 特別研究員奨励費
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 外国
• 研究分野: 生物物理学
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 四方 哲也 大阪大学, 大学院・情報科学研究科, 助教授
• 研究分担者: CHO Jung?Hwa 大阪大学, 大学院・情報科学研究科, 外国人特別研究員 ; CHO J.-H.
• 研究期間 (年度): 2002
• 研究課題ステータス: 完了 (2002年度)
• 配分額: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円); 2002年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円); 2001年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
• キーワード: QβRNA複製酵素 / 試験管内無細胞合成系 / 自己複製

研究概要

本研究は、生物の特徴の一つである自己複製という点に注目して、試験管内で自己複製系を構築することを目的としている。具体的には、試験管内でQβRNA複製酵素の遺伝子から、wheat germの蛋白質合成系を用いてQβRNA複製酵素を合成し、その酵素が自分の遺伝子を複製する系を構築する。この系を構築することによって、生物の進化をより深く理解することができると思われる。
Qβレプリカーゼは、Qβファージ由来のRNA依存性RNA複製酵素である。Qβレプリカーゼは、ファージ由来のβサブユニットおよび、宿主である大腸菌由来のリボソーム因子S1タンパク質とタンパク質伸長因子EF-Tu、EF-Tsの4つのサブユニットから構成される。本酵素が活性を持つ為には、これらのサブユニットが正しく会合する必要があると思われる。実際、大腸菌内や大腸菌無細胞タンパク質翻訳系を用いβサブユニットを発現させると不溶化する。そこで、本研究では、S1、EF-Tu、EF-Tsのタンパク質の量を人為的にコントロールし、Qβレプリカーゼが活性を持つ為に必要なサブユニットの条件を、小麦胚芽無細胞タンパク質翻訳系を用い調べた。本翻訳系は、Qβレプリカーゼのサブユニットが含まれない。具体的には、Qβレプリカーゼのβサブユニットを無細胞翻訳系を用い合成した。その際、系に加えるS1、EF-Tu、EF-Tsのタンパク質の量を変え、βサブユニットの合成量とQβレプリカーゼの複製活性について調べた。
その結果、小麦胚芽無細胞タンパク質翻訳系においては、βサブユニットは他のサブユニットが存在しなくても大部分が可溶性となった。また、系にタンパク質伸長因子EF-Tu、EF-Tsが6×10-7 M存在すれば、活性を持つQβレプリカーゼが合成できることがわかった。更に、翻訳中にS1タンパク質が存在するとβサブユニットの合成量が減るが、βサブユニットの翻訳後にS1タンパク質を加えると活性が上がることがわかった。
試験管内無細胞合成系でRNA依存性RNA複製酵素を活性ある形で作り出すことが出来ているので、これを使って、RNA複製酵素とその遺伝子を用いた自己複製系の立ち上げを行える。このシステムは常温で自己複製が行えるシステムで、リポゾームなどを用いた人工細胞を構築する上で基盤技術でもある。