| 研究課題/領域番号 |
01J00507
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 国内 |
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| 研究分野 |
生物物理学
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
西野 達哉 大阪大学, 医学系研究科, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
3,900千円 (直接経費: 3,900千円)
2003年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
2002年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
2001年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
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| キーワード | 遺伝子相同組換え / DNA修復 / X線結晶構造解析 / たんぱく質立体構造 / ホリデー分岐構造 / 遺伝子複製フォーク / 相同組み換え / ドメイン解析 / 変異体解析 |
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| 研究概要 |
今年度はホリデー分岐および複製フォークに作用する古細菌Hefの更なる立体構造解析を行った。
まず、HefのN末端より三分の二を占めるヘリカーゼドメインの立体構造解析を行い、原子レベルで立体構造を決定した。Hefのヘリカーゼドメインは構造的に三つのドメインに分けることができ、このうちの二つのドメインはヘリカーゼに共通して見られるフォールドを有していた。これに対して、Hef特異的ドメインは他のヘリカーゼには見られないアルファーヘリックスのみからなるドメインであった。このドメインの機能を調べるため欠失変異体およびアミノ酸残基特異的置換変異体を作成し、ヘリカーゼ活性を測定した。その結果、このドメインはATP加水分解活性を保持していたものの、複製フォークを解消する機能が欠失していた。しかし、興味深いことに、ホリデー分岐の解消機能は有しており、二つのDNA基質間で異なる認識機構が存在していることがわかった。
一方、C末端に位置するヘリックスヘアピンヘリックス(HhH)ドメインについても立体構造解析を行い、原子レベルで立体構造を決定した。このドメインは、昨年度の生化学的解析から予想されたように結晶中で二量体を形成していた。その相互作用は今までに知られている様式とは異なり、疎水性相互作用による強固な二量体を形成していた。HhHドメイン変異体を作成したところ、このドメインはヌクレアーゼ活性に必須であった。さらに、タンパク質-DNA相互作用を解析するためフットプリントを行ったところ、ヌクレアーゼドメインはフォーク構造の中心部を認識し、HhHドメインは二重鎖DNAを認識していることがわかった。
以上の解析および昨年度までの解析から、ホリデー分岐を切断するHjcタンパク質の立体構造と機能、複製フォークを認識切断するHefの立体構造と機能が明らかになった。これらの結果より、ホリデー分岐や複製フォークがいかにして認識され切断されるかが解明された。
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