| 研究分担者 |
KIRSCJ J.F. カルフォルニア大学, 生化学, 教授
ARNONE A. アイオワ大学, 生化学, 教授
METZLER D.E. アイオワ州立大学, 生化学, 教授
広津 建 大阪市立大学, 理学部, 教授 (10047269)
矢野 貴人 大阪医科大学, 助手 (40239827)
林 秀行 大阪医科大学, 講師 (00183913)
倉光 成紀 (倉光 成記) 大阪大学, 理学部, 教授 (60153368)
棚瀬 純男 熊本大学, 医学部, 助教授 (20112401)
鏡山 博行 大阪医科大学, 教授 (80028555)
KIRSCH J.F. カルフォルニア大学, 生化学, 教授
樋口 泰一 大阪市立大学, 理学部, 教授 (40046868)
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| 研究概要 |
我々が従来より行ってきたアスパラギン酸アミノ基転移酵素(AspAT)に関する酵素化学的研究は,近年,遺伝子工学の手法の導入により新たな展開を迎えた。我々は酵素の機能発現と密接に関係すると推定される構造部位に人為的に数十種類の変異を導入し,その改変された酵素機能を酵素化学的,蛋白化学的の解析することにより,触媒機能と構造との関連を明確にしつつある。しかし,変異の導入に伴って起こると推定される極微細な構造変化を直接とらえる手段は,従来の蛋白化学的方法では適用限界があり,X線結晶解析に頼らざるを得ない。一方,国内外では本酵素のX線結晶解析が行われ,基質類似体との複合体構造を解析することにより酵素機能と密接に関わる構造が明らかになりつつある。しかし,X線結晶解析では,酵素構造の動的変化を経時的に観察することは不可能で,主として基質およびアナログとの反応動力学的解析により得られる情報が,データの解析に不可欠となっている。本共同研究では,酵素の機能と構造に関し,この2つの解析法の接点にわれわれの作成する変異酵素を置き,変異酵素のX線結晶解析を行い,既に得られている野性型酵素の構造データと比較検討することにより,変異の導入にともなう構造の変化に関する情報を得ることを目的とし,平成2年度から4年度にわたり,延べ10名の研究者を派遣し,2名の外国人研究者を招へいした。
ブタAspATは,補酵素(PLP)を結合し活性域の大部分を構成する大ドメインと,基質の結合により活性中心に向かって動く小ドメインからなり,特に,小ドメイン内のアミノ基末端セグメント領域が″induced fit″というべき構造変化により活性中心を外部環境から遮断することにより,本酵素反応のキーステップである基質アミノ酸のα-水素の引抜きとそれに続くプロトン移動を特異的かつ効率的に起こさせると想定される。森野,棚瀬は,このアミノ基末端セグメント領域の残基15〜18及び36〜39の変異酵素を作成した。また,触媒のための適切な環境づくり,電子の移動などに関係していると考えられる活性域近傍に位置するHis残基の変異酵素を作成した。これらの酵素を米国に持参または送付し,X線結晶解析(Arnone)ならびにNMRによる解析(Metzler)を行った。その結果,1)Helix1を構成するVal15,Leu16残基のAsp,Proなどへの置換により基質との親和性は大きく低下するが,酵素蛋白の安定性は増すこと,2)Val17,Phe18残基は基質との結合を安定化するのに適切な疎水性とかさ高さを提供していること,Phe18のHis置換体のNMR観察から,このHis残基が基質結合に伴う構造変化を観察する指標となること,3)Val37,Gly38残基のAla,Serなどへの置換は基質結合に伴う構造変化を抑制し,触媒能を低下させること,4)補酵素結合部位深部に位置するHis143,189,193は協同して活性域に正電荷を提供し,触媒過程における電荷状態変化を適切に維持していることなどが示された。
鏡山,倉光らは,大腸菌AspATを材料とし,主に活性域内にあり,基質や補酵素と直接相互作用し,結合や触媒反応に関連するアミノ酸残基の置換を行った。これらの変異酵素のX線結晶解析は広津が担当した。また米国で同じく大腸菌AspATの変異酵素を作成し機能構造相関を研究するKirschらのグループと討論を行った。その結果,1)PLPりん酸基近くのTyr70はPLPとの結合への関与は少なく,遊離型Lys258のε-アミノ基と相互作用する可能性があること,2)Tyr225とAsp222は触媒過程における補酵素の電子状態を大きく左右していること,3)Asp222と水素結合するHis143のPLPの電荷状態への影響は少ないこと,4)基質ω-カルボキシル基を結合するArg292の電荷の消失によりジカルボン酸基質との親和性を失い,芳香族アミノ酸基質に対する活性が増大すること,Argと同じ正電荷を持つLysではカルボキシル基の認識には不十分で代用できないことなどが観察された。
X線結晶解析結果から,いずれの変異酵素においてもアミノ酸置換による酵素全体構造への影響は認められないこと,ほんどの変異酵素で置換した側鎖も元の位置を占めており,構造変化は置換したアミノ酸残基周辺に限られていることが明らかとなった。アミノ酸残基置換による酵素触媒機能への影響を考察する際,構造変化が局所に留まっていることが確認された意義は大きいと考えられる。
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