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結晶構造に基ずくチトクロム酸化酵素の反応機構の研究

研究課題

研究課題/領域番号 02044126
研究種目

国際学術研究

配分区分補助金
応募区分共同研究
研究機関姫路工業大学

研究代表者

吉川 信也  姫路工業大学, 理学部, 教授 (40068119)

研究分担者 WINSLOW S.CA  コロラド州立大学, 生物化学科, 教授
ROBERT O.POY  コロラド大学, 分子生物学科, 教授
月原 富武 (月原 冨武)  徳島大学, 工学部, 教授 (00032277)
CAUGHEY Winslow S.  Department of Biochemistry, Colorado State University
POYTON Robert O.  Department of Molecular Biology, University of Colorado
CAUGHEY Wins  コロラド州立大, 生化学科, 教授
POYTON Rober  コロラド大学, 分子生物学科, 教授
研究期間 (年度) 1990 – 1992
研究課題ステータス 完了 (1992年度)
配分額 *注記
8,500千円 (直接経費: 8,500千円)
1992年度: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
1991年度: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
1990年度: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
キーワードチトクロム酸化酵素 / 膜タンパク質 / 結晶化 / X線結晶解析 / 呼吸鎖 / 電子伝達複合体 / ミトコンドリア呼吸鎖 / 赤外吸収 / x線結晶解析
研究概要

結晶化に及ぼす要因は無数にあるが我々はこれまでウシ心筋チトクロム酸化酵素の結晶化に関して以下のような要因について検討してきた。過飽和度,緩衝液の種類,イオン強度,添加剤や可溶化標品の安定化のための界面活性剤の種類と濃度,沈澱剤の種類,温度重力,結晶化容器の形状と材質,結晶化方法(蒸気拡散法,バッチ法),空気中の酸素の影響,酸化還元や配位子結合状態,生物種。これらの内で最も重要なものは界面活性剤の種類であった。現在,7種類の界面活性剤が標品を結晶化させるに十分なほどこの酵素を安定化するのに有効であることを見いだした。その内で,BL8SY(CH_3(CH_2)_<11>(0CH_2CH_2)_80Hによって可溶化された標品から最も高い分解能を示す結晶が得られた。現在6Å分解能で相関係数0.5以上,7Å分解能で0.8以上のX線回折を示す結晶を得ている。しかし,5Α分解能以上の回折を示す結晶も再現性は良くないが得られている。その再現性が低い原因は酸素により作られるラジカルによるタンパク質の損傷や物理的衝撃による損傷にあると考えられる。したがってX線回折実験のときの結晶の取扱方法を改善することによって更に分解能は改善される可能性がある。この結晶の重原子誘導体化にも成功し,重原子の位置も決定されつつある。また,容器の材質も結晶化に重要な要因であることが明らかにされた。たとえばアルキルオキシエチレン系界面活性剤を含む標品ではガラス容器で4℃付近に結晶化の最適条件があるが,アルキル化糖系界面活性剤を含む標品ではプラスチック容器で20℃付近に最適条件が見いだされた。
分子置換法による位相決定を試みたが,Hendersonらの電子線回折のデータの誤差のレベルが高いため,精度の高い結果は得られなかった。そこで,電子線回折実験のための二次元結晶化を試みた。その結果,三次元結晶を作れる程度の標品からは非常によい二次元結晶が得られることが認められ,電子線回折の結果はHendersonらの結果と相当に異なることが示された。現在10Å分解能の立体構造の決定のための精密化を急いでいる。また細菌(パラコッカス)のチトクロム酸化酵素の精製条件を確立し,二次元結晶化にも成功した。現在高等動物型酵素との比較のため,電子線回折にとりくんでいる。また,二次元結晶が得られたと言うことは三次元結晶が得られる可能性を強く示唆している。コウボチトクロム酸化酵素については精製法の価格率に非常に手間どり,今年度になってはじめて成功した。その方法はこれまでのSekuzu法やPoyton法にくらべて収量,再現性ともに格段に改良されている。さらに最終標品は界面活性剤を含まない緩衝液に完全に溶解された。現在のところ,三次元結晶化には成功していないが,この性質は結晶化が可能であることを強く示唆している。(ウシ酵素では,このような性質を持つ我々の標品だけが結晶になっている。)その他,いくつかの変異株の酵素の精製も試みた。
CO化型単結晶の赤外異方性の解析のため,以下のような方法を試みた。結晶の方位はX線回折実験によって決定しなければならないが,赤外分光の窓材であるCaF_2やサファイヤのX線吸収は相当に強い。一方石英は強い赤外吸収がある。そこで,まず単結晶酵素の電子スペクトルの異方性をX線回折実験のキャピラリー中で顕微分光装置にゴニオメータを設置して測定する。次にサファイアかCaF_2の細管に結晶を置き,上述のようにして決定された電子スペクトルの異方性を手がかりにして結晶の方位を決定し赤外異方性を測定する。これらの実験は全て嫌気条件下で行う必要がある。そこで自動酸化性のないCOミオグロビンやCOヘモグロビンによって予備実験と装置の改良を行った。まずサファイヤでは内径1mmで外径2mm,DaF_2では内径1mm外径3mmの細管は作れたが,どちらも内側の研磨は不可能であった。これによって顕微分光装置を用いて電子スペクトルの測定を試みたが,散乱が強すぎて精度の高いスペクトルは得られていない。現在この細管の散乱効果を低くする方法を試みている。しかし,X線回折実験用のキャピラリー中の結晶のスペクトルの測定は可能で,基本的にはこの方法で赤外異方性の測定が可能であることは確認できた。

報告書

(3件)
  • 1992 研究成果報告書概要
  • 1991 実績報告書
  • 1990 実績報告書
  • 研究成果

    (43件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (43件)

  • [文献書誌] T.KUBOTA and S.YOSHIKAWA: "Hydrazne and hydroxylamine as probes for O_2 reduction site of mitochondrial cytochrome c oxidase." Biochem.J.(1993)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] W.S.Caughey,A.Dong,V.Sampath,S.YOSHIKAWA and X.-J.Zhao: "Probing heartY cytochrome c oxidase structure and function by infrared spectroscpy" J.Bioenergetics.(1993)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M.TSUBAKI,K.Shinzawa-Itoh and S.YOSHIKAWA: "Effects of crystallization on the heme-carbon monoxide moiety of bovine heart cytochrome c oxidase carbonyl." Biophys.J. (1993)

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  • [文献書誌] "Single crystals of bovine heart cytochrome c oxidase at fully oxidized resting,fully reduced and CO bound fully reduced states are isomorphous with each other." J.Mol.Biol.122. 298-302 (1992)

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  • [文献書誌] M.ATAKA,K.Shinzawa-Itoh and S.YOSHIKAWA: "Phase diagrams of a membrane protein,bovine heart cytochrome c oxidase,the salting-in region." J.Cryst.Growth.122. 60-65 (1992)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] S.YOSHIKAWA,K.Shinzawa-Itoh,H.UEDA,T.TSUKIHARA,Y.FUKUMOTO,T.KUBOTA,M.KAWAMOTO,K.FUKUYAMA and H.MATSUBARA: "Strategies for crystallization of membrane protein complexes." J.Cryst.Growth.122. 298-302 (1992)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] S.TUJI,K.Shinzawa-Itoh,T.ERATA,A.NAITO,S.YOSHIKAWA and H.SAITO: "A high resolution solid-state ^<13>C-NMR study on crystalline bovine heart cytochrome-c oxidase and lysozyme:dynamic behavior of protein and detergent in the complex." Eur.J.Biochem.208. 713-720 (1992)

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  • [文献書誌] S.TAKAHASHI,T.OGURA,K.Itoh-Shinzawa,S.YOSHIKAWA and T.KITAGAWA: "Observation of the copper A ligand stretching resonance Raman band for cytochrome c oxidase." J.Am.Chm.Soc.113. 9400-9401 (1992)

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  • [文献書誌] S.YOSHIKAWA and W.S.Caughey: "Infrared evidence of azide binding to iron,copper and non-metal sites in heart cytochrome c oxidase." J.Biol.Chem.267. 9757-9766 (1992)

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  • [文献書誌] T.KUBOTA,S.YOSHIKAWA and H.MATSUBARA: "Kinetic mechanism of beef heart ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase." J.Biochem.111. 91-98 (1992)

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  • [文献書誌] T.KUBOTA,M.KAWAMOTO,K.Shinzawa-Itoh,S.YOSHIKAWA,H.MATSUBARA: "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of bovine heart mitochondrial cytochrome bc_1 complex." J.Mol.Biol.221. 379-382 (1991)

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  • [文献書誌] T.OGURA,S.TAKAHASHI,K.Shinzawa-Itoh,S.YOSHIKAWA and T.KITAGAWA: "Time-resolved resonance raman investigation of cytochrome oxidase catalysisobservation of a new oxygen-isotope sensitive raman band." Bull.Chem.Soc.Jpn.64. 2901-2907 (1991)

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  • [文献書誌] S.YOSHIKAWA,K.SHINZAWA,T.TSUKIHARA,T.ABE and W.S.Caughey: "Crystallization of Beef Heart Cytochrome c Oxidase." J.Cryst.Growth.110. 247-251 (1991)

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  • [文献書誌] T.OGURA,S.TAKAHASHI,K.Sinzawa-Itoh,S.YOSHIKAWA and T.KITAGAWA: "Observation of the fe^<4+>=O Stretching Raman Band for Cytochrome Oxidase Compound B at Ambient Temperature." J.Biol.Chem.265. 14721-14723 (1990)

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  • [文献書誌] T.OGURA,S.TAKAHASHI,K.Shinzawa-Itoh,S.YOSHIKAWA and T.KITAGAWA: "Observation of the Fe^<11>-O_2 Stretching Raman Band for Cytochrome Oxidase Compound A at Ambient Temperature." J.Am.Chem.Soc.112. 5630-5631 (1990)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] S.YOSHIKAWA and W.S.Caughey: "Infrared Evidence of Cyanide Binding to Iron and Copper Sites in Bovine Heart Cytochrome c Oxidase.Implications regarding Oxygen Reduction" J.Biol.Chem.265. 7945-7958 (1990)

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  • [文献書誌] T. Kubota and S.Yoshikawa: "Hydrazine and hydroxylamine as probes for O_2 reduction site of mitochondrial cytochrome c oxidase." Biochem. J.(1993)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] W.S.Caughey, A.Dong, VV.Sampath, S.Yoshikawa and X.-J.Zhao: "Probing heart cytochrome c oxidase structure and function by infrared spectroscopy." J. Bioenergetics.(1993)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M.Tsubaki, K.Shinzawa-Itoh and S.Yoshikawa: "Effects of crystallization on the heme-carbon monoxide moiety of bovine heart cytochrome c oxidase carbonyl." Biophys. J.(1992)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] K.Shinzawa-Itoh, H.Yamashita, Y.Fukumoto, T.Abe and T.Tsukihara: "Single crystals of bovine heart cytochrome c oxidase at fully oxidized resting fully reduced and CO bound fully reduced states are isomorphous with each other." J. Mol. Biol.228. 987-991 (1992)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] M.Ataka, K.Shinzawa-Itoh and S.Yoshikawa: "Phase diagrams of a membrane protein, bovine heart cytochrome c oxidase, in the salting-in region." J. Cryst. Growth.122. 60-65 (1992)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] S.Yoshikawa, K.Shinzawa-Itoh, H.Ueda, T.Tsukihara, Y.Fukumoto, T.Kubota, M.Kawamoto, K.Fukuyama and H.Matsubara: "Strategies for crystallization of membrane protein complexes." J. Cryst. Growth.122. 298-302 (1992)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] S.Tuji, K.Shinzawa-Itoh, T.Erata, A.Naito, S.Yoshikawa and H.Saito: "A high resolution solid-state ^<13>C-NMR study on crystalline bovine heart cytochrome c oxidase and lysozyme : dynamic behavior of protein and detergent in the complex." Eur. J. Biochem.208. 713-720 (1992)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] T.Ogura, K.Itoh-Shinzawa, S.Yoshikawa and T.Kitagaswa: "Observation of the copper A ligand stretching resonance Roman band for cytochrome c oxidase" J. Am. Chm. Soc.113. 9400-9401 (1992)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] S.Yoshikawa and W.S.Caughey: "Infrared evidence of azides binding go iron, copper and non-metal sites in heart cytochrome c oxidase." J. Biol. Chem.267. 9757-9766 (1992)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] S.Yoshikawa and H.Matsubara: "Kinetic mechanism of beef heart ubiquinol : cytochrome c oxidoreductase." J. Biochem.111. 91-98 (1992)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] T.Kubota, M.Kawamoto, K.Shinzawa-Itoh, S.Yoshikawa, H.Matsubara: "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of bovine heart mitochondrial cytochrome bc_1 complex." J. Mol. Biol.221. 379-382 (1991)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] T.Ogura, S.Takahashi, K.Shinzawa-Itoh, S.Yoshikawa and T.Kitagawa: "Time-resolved resonance raman investigation of cytochrome oxidase catalysis : observation of a new oxygen-isotope sensitive raman band." Bull. Chem. Soc. Jpn.64. 2901-2907 (1991)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] S.Yoshikawa, K.Shinzawa, T.Tsukihara, T.Abe and W.S.Caughey: "Crystallization of Beef Heart Cytochrome c Oxidase." J. Cryst. Growth.110. 247-251 (1991)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] T.Ogura, S.Takahashi, K.Shinzawa-Itoh, S.Yoshikawa and T.Kitagawa: "Observation of the Fe^<4+>=O Stretching Raman Band for Cytochrome Oxidase Compound B at Ambient Temperature." J. Biol. Chem.265. 14721-14723 (1990)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] T.Ogura, S.Takahashi, K.Shinzawa-Itoh, S.Yoshikawa and T.Kitagawa: "Observation of the Fe^<11>-O_2 Stretching Raman Band for Cytochrome Oxidase Compound A at Ambient Temperature." J. Am. Chem. Soc.112. 1990 (1990)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] 5630-5631: "Infrared Evidence of Cyanide Binding to Iron and Copper Sites in Bovine Heart Cytochrome c Oxidase. Implications regarding Oxygen Reduction." J. Biol. Chem.265. 7945-7958 (1990)

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      1992 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] S.Yoshikawa: "Strategies for crystallization of membrane protein complexes." J.Cryst.Growth.

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書
  • [文献書誌] M.Ataka: "Phase diagrams of a membrane protein,bovine heart cytochrome c oxidase,in the salting-in region." J.Cryst.Growth.

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書
  • [文献書誌] S.Takahashi: "Observation of the copper A.-Copper A ligand stretching resonance Raman band for cytochrome c oxidase." J.Am.Chm.Soc.

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書
  • [文献書誌] S.Yoshikawa: "Infrared evidence of azide binding to iron,copper and non-metal sites in heart cytochrome c oxidase." J.Biol.Chem.

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書
  • [文献書誌] T.Kubota: "Crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of bovine heart mitochondrial cytochrome bc_1 complex." J.Mol.Biol.221. 379-382 (1991)

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書
  • [文献書誌] S.Yoshikawa: "Crystallization of Beef Heart Cytochrome c Oxidase." J.Cryst.Growth.110. 247-251 (1991)

    • 関連する報告書
      1991 実績報告書
  • [文献書誌] Yoshikawa,S.,ShinzawaーIto,K.,Tsukihara,T.,Abe,T.,and Caughey,W.S.: "Crystallization of Beef Heart Cytochrome c Oxidase." J.Cryst.Growth.(1991)

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      1990 実績報告書
  • [文献書誌] Tsukihara,T.,Abe,T.,ShinzawaーIto,K.,Ueda,H.,Yoshikawa,S.,and Caughey,: "TwoーFold Symmetry in Crystalline Bovine Heart Cytochrome c Oxidase." J.Mol.Biol.(1991)

    • 関連する報告書
      1990 実績報告書
  • [文献書誌] Ogura,T.,Takahashi,S.,ShinzawaーIto,K., Yoshikawa,S.,and Kitagawa,T.: "Observation of the Fe^<4+>=0 Stretching Raman Band for Cytochrome Oxidase Compound B at Ambient Temperature." J.Biol.Chem.265. 14721-14723 (1990)

    • 関連する報告書
      1990 実績報告書
  • [文献書誌] Ogura,T.,Takahashi,S.,ShinzawaーIto,K.,Yoshikawa,S.,and Kitagawa,T.: "Observation of the Fe^<11>ー0_2 Stretching Raman Band for Cytochrome Oxidase Compound A at Ambient Temperature." J.Am.Chem.Soc.112. 5630-5631 (1990)

    • 関連する報告書
      1990 実績報告書
  • [文献書誌] Yoshikawa,S.,and Caugehy,W.S.: "Infrared Evidence of Cyanide Binding to Iron and Copper Sites in Bovine Heart Cytochrome c Oxidase.Implications regarding Oxygen Reduction." J.Biol.Chem.265. 7945-7958 (1990)

    • 関連する報告書
      1990 実績報告書

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公開日: 1990-04-01   更新日: 2016-04-21  

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