| 研究概要 |
本年度は、rareーcutter部位を目印にしてHTF islandを選択的にクロ-ニングする為の方法論を重点的に検討し、以下の2つのストラテジ-を確立した。
1)物理的選択法(PFーPAGE法)
プラスミドベクタ-にサブクロ-ン化したヒト21番染色体ライブラリ-全体より調製したプラスミドをrareーcutter処理し、切断されて線状化された分子のみを私の開発したPFーPAGE(Pulsedーfield polyacrylamide Gel Electrophoresis)法を用いて分離回収し、再環状化後大腸菌に導入することによりリンキングライブラリ-を作製した。今年度は特に、PFーPAGEに不連続緩衝液系の導入を中心に改良を加え、分離時間の大幅な短縮と操物性の著しい向上をみた(Genomics,印刷中)。この改良法を利用して、NotI,BssHIIのリンキングラブラリ-を作製した。
2)生物学的選択法
21番染色体ライブラリ-のインサ-トDNAを自己環状化させた後に、rareーcutterで消化し新たに構築したpTZ19RGベクタ-の当該rareーsite(Notl,BssHII,EagI,SacII)にクロ-ニングすることにより、リンキングライブラリ-を作製した。
このようにして得られたクロ-ンのうちNotIを中心に数十クロ-ンの塩基配列を決定したところ、これらの領域は極めてGCーrich(60ー90%)であり、CpGサプレッションがみられず(Cpg=GpC)、rarecutter siteに富み、また進化的にも良く保存されているという典型的HIF islandの特徴を備えていたことより、このアプロ-チの妥当性が示された。但しこれらの中には、ユニ-ク配列のみならずいくつかの反復配列ファミリ-も含まれており、従来マウスやニワトリで得られてきた知見とは、様相を異にする面も明らかになりつつある。また電気泳動に於ける挙動の異常なクロ-ンも得られており、特殊なDNA構造の存在も示唆され興味深い。
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