| 研究課題/領域番号 |
02453150
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| 研究種目 |
一般研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
物質生物化学
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
高橋 健治 東京大学, 理学部, 教授 (70011533)
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| 研究分担者 |
井上 英史 東京大学, 理学部, 助手 (20184765)
高橋 孝行 東京大学, 理学部, 講師 (80197152)
田之倉 優 東京大学, 理学部, 講師 (60136786)
丹治 雅夫 東京大学, 理学部, 特別研究員(PD) (50212048)
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| 研究期間 (年度) |
1990 – 1991
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| 研究課題ステータス |
完了 (1991年度)
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| 配分額 *注記 |
5,800千円 (直接経費: 5,800千円)
1991年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
1990年度: 4,400千円 (直接経費: 4,400千円)
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| キーワード | カルボキシルプロテア-ゼ / 酸性プロテア-ゼ / プロクタ-ゼA / カテプシンE / コピアプロテア-ゼ / 粘菌酸性プロテア-ゼ / プロテア-ゼ前駆体 / 自己触媒的活性化 / 水溶性カルボジイミド / 基質特異性 / cDNA / X線結晶解析 / NMR / 遺伝子 / トランスポゾンプロテア-ゼ / 粘菌プロテア-ゼ / ペプシノ-ゲン |
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| 研究概要 |
1.クロコウジカビ(Aspergillus niger)の産生する新しいタイプのカルボキシルプロテア-ゼ(プロクタ-ゼA)の完全一次構造と蛋白化学的手法により決定するとともに、その遺伝子およびcDNAをクロ-ニングし、塩基配列を決定した。
2.プロクタ-ゼAの基質特異性を検索するとともに、活性部位残基の化学修飾による同定を進めた。また、そのプロ体cDNAを大腸菌で発現させ、酸性条件下で活性化させることに成功した。
3.プロクタ-ゼAの結晶化に成功し、X線結晶解析を進めた。また、二次元NMRおよびCDスペクトルの分析から、β構造含量が高く、分子中に堅いコア構造を有することを明らかにした。
4.プロクタ-ゼAのpH変性過程を種々の方法で比較解析し、pH6〜7の狭いpH域で、高次構造の大きな変化と、構成二本鎖ペプチドの解離を伴い、急速かつ不可逆的に失活することを明らかにした。
5.粘菌(Physarum poly Cephalum)の菌体内より、分子量54,000の新しいタイプのペプスタチン非感受性酸性プロテア-ゼを精製し、ユニ-クな二本鎖構造と基質特異性を持つことを示した。
6.ヒト胃粘膜よりカテプシンE前駆体を精製し、糖鎖結合部位およびN末端域構造を明らかにするとともに、酸性pHで自己触媒的にカテプシンEに変換することを示した。また、カテプシンEが中性pH域においても活性を持つこと、また基質特異性が中性ではより狭くなることを明らかにした。
7.ショウジョウバエのトランスポゾン由来のコピアプロテア-ゼを大腸菌で発現させ、活性酵素を得ることに成功した。また、その切断持異性を明らかにするとともに、推定活性部位Asp残基が活性発現に必須であることを部位指向突然変異法により明らかにした。
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