| 研究課題/領域番号 |
02454097
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| 研究種目 |
一般研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
基礎獣医学
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| 研究機関 | 帯広畜産大学 |
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研究代表者 |
品川 森一 帯広畜産大学, 畜産学部, 教授 (00001537)
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| 研究分担者 |
堀内 基広 帯広畜産大学, 畜産学部, 助手 (30219216)
石黒 直隆 帯広畜産大学, 畜産学部, 助教授 (00109521)
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| 研究期間 (年度) |
1990 – 1991
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| 研究課題ステータス |
完了 (1991年度)
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| 配分額 *注記 |
6,200千円 (直接経費: 6,200千円)
1991年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
1990年度: 4,500千円 (直接経費: 4,500千円)
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| キーワード | スクレイピ- / 伝達性海綿状脳症 / PrP遺伝子 / 培養細胞 / 遺伝子発現 / 分子クロ-ニング |
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| 研究概要 |
ヒツジ及びウシ脳から得たmRNA画分からcDNAライブラリ-を作成しPrPのcDNAのクロ-ニングを行った。ウシでは2096塩基対から成るクロ-ンが得られたが、ヒツジでは成功しなかった。ヒツジでは染色体DNAからこの遺伝子のコ-ド領域を含む制限酵素断片をクロ-ニングした。さらにPCR法によってヒツジ及びウシの複数の個体から遺伝子をクロ-ニングし、比較解析した。これら遺伝子をそれぞれ発現ベクタ-pcDLーSRa296に組み込み、G418耐性マ-カ-を付与して発現プラスミドを作成した。またウシcDNAを基本として、PrPのN端に欠損を持ったもの及び一部アミノ酸置換が起きるように変異させた遺伝子も作成した。これらをリン酸カルシュウム沈澱法によってマウスL細胞に導入し、G418耐性コロニ-を分離した。何れの遺伝子によっても、それらのPrP^cを核周辺に強く発現している細胞が得られた。しかしヒツジPrP遺伝子を導入した細胞は時間と共に発現する細胞が減少した。ウシ遺伝子を入れた細胞のクロ-ニングにより全ての細胞がウシPrP^cを発現し続けるクロ-ンを樹立した。このクロ-ン化細胞に感染脳乳剤あるいはSAF画分を感染させた細胞には細胞質全体に微細顆粒状の蛍光が認められた。対照の感染L細胞でも同様の所見が得られたが、継代によってそのような細胞が速やかに消失した。変異遺伝子を導入した細胞に付いては時間的な関係で凍結保存し、まだ解析に至っていない。
SAF遺伝子を扱った培養細胞での成績を理解し解釈する助けとしてSAそのものの解析を行っている。SAFに存在するかも知れない特異核酸を感染性を指標に検出することを試みたが成功しなかったはできなかったしかしSAFから精製分離したPrP^<sc>そのものに感染を証明することが出来た。PrP^<sc>に共有給合した核酸の存在の可能性を検討したが、検出出来なかった。
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