| 研究課題/領域番号 |
02454142
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| 研究種目 |
一般研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
医化学一般
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
橘 正道 千葉大学, 医学部, 教授 (50009081)
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| 研究分担者 |
園田 智子 千葉大学, 医学部, 教務職員 (20143307)
石塚 俊治 千葉大学, 医学部, 助手 (50232294)
石嶌 純男 千葉大学, 医学部, 助手 (70184520)
鈴木 信夫 千葉大学, 医学部, 助教授 (90111426)
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| 研究期間 (年度) |
1990 – 1992
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| 研究課題ステータス |
完了 (1992年度)
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| 配分額 *注記 |
6,400千円 (直接経費: 6,400千円)
1992年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
1991年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
1990年度: 3,100千円 (直接経費: 3,100千円)
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| キーワード | 核酸前駆体合成 / ホスホリボシルピロリン酸合成酵素 / アイソフォーム / フィードバック阻害 / プロモーター領域 / マグネシウムイオン / 増殖刺激 / 蛍光色素 / 制御タンパク / アイソフォ-ム / フィ-ドバック阻害 / 発現ベクタ- |
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| 研究概要 |
細胞が外部刺激に応答して活動を増加させるさい、多くはヌクレオチド合成の亢進を伴う。ヌクレオチド合成の共通基質であり、鍵制御物質であるホスホリボシルピロリン酸(PRPP)の合成調節に注目して、遺伝子工学の手法によるPRPP合成酵素の性質をしらべる一方、制御因子としてのMg^<2+>の変動の解析を細胞レベルで行った。1.PRPP合成酵素に関する研究(1)ラットPRPP合成酵素サブユニットIおよびIIの大腸菌における発現と各酵素の精製と性質の検討:両サブユニット(PRSI、PRSII)は単独で酵素活性を示した。ヌクレオチド(ADP,GDP)による阻害、硫酸イオンに対する応答、熱安定性に著しい差があった。(2)ヒトPRPP合成酵素のcDNAクローニングとゲノム遺伝子解析(i)高尿酸血症を伴うPRPP合成酵素の亢進症を解析する基礎としてヒトPRSIcDNAのクローニングを行った。膠芽腫MGCI細胞のcDNAライブラリーより、全長を含むヒトPRSIcDNAクローンを得た。ヒトとラットの相同性は極めて高く、またPRSIとIIの分岐はアミノ酸配列の相違度より求めた分子進化速度から約7億6千万年前と計算された。(ii)ヒトPRPS1とPRPS2遺伝子のプロモーター領域をクローニングした。両プロモーターは、CCAATボックス、Spl結合部位、TATAボックス様配列が存在した。両プロモータの配列に相同性は認められず、別々の発現調節を受けていることが示唆された。CAT活性とmRNA量との比較から、得られた5'上流領域は両遺伝子の発現を細胞の個性に応答して支配する配列を含むことが示唆された。2.Swiss3T3細胞における増殖刺激後のMg^<2+>動態の解析(1)蛍光色素mag-fura-2と蛍光顕微画像解析法を用いて細胞内のMg^<2+>濃度を単一細胞レベルで測定する方法を確立した。(2)細胞に増殖因子(EGFまたはボンベシン)を加えると1時間以内にMg^<2+>濃度が上昇し、インスリンを同時に加えるとさらに上昇した。Mg^<2+>濃度の変化が修飾因子として細胞活動を規定している可能性が直接示された。
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