Gene Targeting法によるT細胞シグナル伝達機構の解析

• 研究課題/領域番号: 02454185
• 研究種目: 一般研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 免疫学
• 研究機関: 千葉大学
• 研究代表者: 斉藤 隆 千葉大学, 医学部・高次機能制御研究センター・遺伝子情報分野, 教授 (50205655)
• 研究期間 (年度): 1990 – 1991
• 研究課題ステータス: 完了 (1991年度)
• 配分額: 6,900千円 (直接経費: 6,900千円); 1991年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円); 1990年度: 4,900千円 (直接経費: 4,900千円)
• キーワード: T細胞抗原レセプタ- / CD3ζ鎖 / ホモロガスリコンビネ-ション / ジ-ンタ-ゲッティング / シグナル伝達機構 / ES細胞 / 遺伝子欠損マウス / ジグナル伝達機構 / T細胞レセプタ-複合体 / CD3ζーη / fyn / 相同組換え / Gene Targeting / 変異株の樹立

研究概要

本研究は,ホモロガスリコンビネ-ションに基づくgene targeting法in vitroでT細胞ハイブリド-マに応用し,抗原認識におけるT細胞シグナル伝達系に関与する抗原レセプタ-複合体や,それに解合するテロシンキナ-ゼなどの分子の機構を解明することを目標とした。標的としたのはCD3ζ.7鎖およびチロシンキナ-ゼfynである。CD37鎖はこれまでゲノム遺伝子構造が未知であったが,本研究でCD3ζ.7は最後のエキソンのみを異にするalternative splicingによって形成されることを発見した。そこで各々の特異的エキソンにneo^γ遺伝子を入れ,3端にTK遺伝子を入れたポジティブ・ネガティブ選択のできるベクタ-を作製した。これらをT細胞ハイブリド-マに導入して,片側アリルに変異を導入したクロ-ンを樹立した。ζ鎖targeting細胞は,通常のmRNA,ζ蛋白,細胞表面T細胞レセプタ-/CD3複合体がほとんどなくなり,抗原刺激にも反応しない機能的に不活性になった。この結果から,ζ鎖が抗原によるT細胞活性化に不可欠であることが,突然変異株でなく,特異的変異株を用いて証明できた。更に,片側アリルのみの不活性変異にもかかわらず,ζ蛋白がほとんど産生されないことから,片側が“Active allele"であると考えられた。両アリルへの変異導入のために,neo^γとhygro^γの両ベクタ-を準備したが,片側の変異で不活化が誘導できた事は,in vitro targetingの有用性を示している。TCR複合体に解合するfynについては,neo^γ/ジフテリア毒素遺伝子を用いる選択方法により試みたが成功に至っていない。更にin vitro targetingの成功を基礎に,CD3ζ,CD37ベクタ-を導入したES細胞の樹立,ES由来の形質を有するキメラマウスの作製に成功し,現在,これらの文配でgernilineに変異を持つマウスを作製している。

研究成果

• [文献書誌] Ohno.H,et al.: "CD3ζ and 7 chains are produced by alternative splicing from a common gene." Int.Immunol.2. 1117-1119 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kuida,K.et al.: "Post-translational attainment of allelic exclusion of T cell receptor α chain in a T cell clone." Int.Immunol.3. 75-82 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ohno,H.et al.: "CD2 can induce TCR/CD3 independent T cell activation." J.Immunol.146. 3742-3746 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ito,T.et al.: "Monoclonal antibody against murine T cell receptor Vα14 cross-reacts with human CD3ε and detects disulfide-linked dimeric from." Int.Immunol.3. 991-995 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Punt,J.A.et al.: "Surface expression of a T cell receptorβ(TCR-β)chain in the absence of TCR-α,-δ,and -γproteins." J.Exp.Med.174. 775-783 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ohno,H.et al.: "Induction of negative signal through CD2 during antigen-specific T cell activation." J.Immunol.147. 2100-2106 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ohno, H. and saito, T.: "CD3zeta and eta chains are produced by alternative splicing from a common gene" Int. Immunol. 2. 1117-1119 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kuida, K., Furutani-Seki, M., Saito, T., Kishimoto, H., Sano, K. and Tada, T.: "Post-translational attainment of allelic exclusion of T cell receptor chain in a T cell clone" Int. Immunol. 3. 75-82 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ohno, H., Ushiyama, C., Taniguchi, M., Germain, R. N. and Saito, T: "CD2 can induce TCR/CD3 independent T cell activation" J. Immunol. 146. 3742-3746 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ito, T., Ishibashi, K., Imai, K., Koseki, H., Ra, C., Fernandez, E., Kantake, M., Saito, T. and Taniguchi, M.: "Monoclonal antibody against murine T cell receptor Valpha14 cross-reacts with human CD3epsilon and detects disufide-linked dimeric form." Int. Immunol. 3. 991-995 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Punt, J. A., Kubo, R., Saito, T., Finkel, T. H., Kathiresan, S., Blank, K. J. and Hashimoto, T.: "Surface expression of a T cell receptorbeta (TCR-beta) chain in the absence of TCR-alpha, -delta, and -gamma proteins" J. Exp. Med. 174. 775-783 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ohno, H., Nakamura, T., Yagita, H., Okumura, K., Taniguchi, M. and Saito, T.: "Induction of negative signal through CD2 during antigen-specific T cell activation" J. Immunol. 147. 2100-2106 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ohno, H., Aoe, T., Ra, C. and Saito, T: "FcepsilonRIgamma can form a functional TCR complex mediating differential signal from CD3zeta-containing TCR complex" J. Immunol.
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Saito, T., Kouyama, K., Dunne, J. F., Ransom, J., Webb, D. and Ohno, H: "No correlation between expression of CD3zeta-etadimer and activation of phosphoinositied pathway" Int. Immunol.
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Aoe, T., Ohno, H., Sonta, S. and Saito, T: "Functional inactivation of CD3zeta chain by in vitro gene targeting in a T cell hybridoma" J. Immunol.
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ohno,H.et al.: "CD3ζ and η chains are produced by alternative splicing from a common qene." J.Immunol.〕46. 3742-3746 (1991)
• [文献書誌] Punt,J.A.et al.: "Surface expression of a T cell receptor β(TCRーβ)chain in the absence of TCRーα,ーδ,and ーγ proteins." J.Exp.Med.174. 775-783 (1991)
• [文献書誌] Ohno,H.et al.: "Induction of negative signal through CD2 during antigenーspecific T cell activation." J.Immunol.147. 2100-2106 (1991)
• [文献書誌] Ohno,H.et al.: "FcεRIγ can form a functional TCR complex mediating differential signal from CD3ζーcontaining TCR complex." J.Immunol.
• [文献書誌] Saito,T.et al.: "No correlation between expression of CD3ζーηdimer and activation of phosphoinositide pathway." Int.Immunol.
• [文献書誌] Aoe,T.et al.: "Functional inactivation of CD3ζ chain by in vitro gene targeting in a T cell hybridoma." J.Immunol.
• [文献書誌] Ohno,H.et al.: "FcεRIγ can form a functional TCR complex mediating differential signal from CD3ζーcontianing TCR complex." J.Immunol.
• [文献書誌] Saito,T.et al.: "No correlation between expression of CD3ζーηdimer and activation of phosphoinositide pathway." Int.Immunol.
• [文献書誌] Aoe,T.et al.: "Functional inactivation of CD3ζ chain by in vitro gene targeting in a T cell hybridoma." J.Immunol.
• [文献書誌] Ohno,H.,Saito,T.: "CD3 and chains are produced by alternative splicing from a common gene." Int.Immunol.2. 1117-1119 (1990)
• [文献書誌] Saito,T.,Fowlkes,B.,Pardoll,D.,Ohno,H.: "A murine thymocyte clone expressing T cell receptor mediates NKーlike cytolytic function and THlーlike lymphokine production." Cell.Immunol.131. 284-302 (1990)
• [文献書誌] Ohno,H.,Ushiyama,C.,Taniguchi,M.,Germain,R.N.,Saito,T.: "CD2 can induce TCR/CD3 independent T cell activation." J.Immunol.(1991)
• [文献書誌] Kuida,K.,FurutaniーSeiki,M.,Saito,T.,Kishimoto,H.,Sano,K.,Tada,T.: "Postーtranslational attainment of allelic exclusion of T cell receptor chain in a T cell clone." Int.Immunol.3. 75-82 (1991)
• [文献書誌] Ohno,H.,Nakamura,T.,Yagita,H.,Okumura,K.,Taniguchi,M.,Saito,T.: "Induction of negative signal through CD2 during antigenーspecific T cell activation." J.Immunol.