| 研究課題/領域番号 |
02454482
|
|---|
| 研究種目 |
一般研究(B)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 研究分野 |
生物系薬学
|
|---|
| 研究機関 | 北海道大学 |
|---|
研究代表者 |
鎌滝 哲也 北海道大学, 薬学部, 教授 (00009177)
|
|---|
| 研究分担者 |
北村 龍司 (北村 竜司) 北海道大学, 薬学部, 助手 (40221212)
伊東 進 北海道大学, 薬学部, 助手 (70223154)
横井 毅 北海道大学, 薬学部, 助教授 (70135226)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
1990 – 1991
|
| 研究課題ステータス |
完了 (1991年度)
|
| 配分額 *注記 |
6,100千円 (直接経費: 6,100千円)
1991年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
1990年度: 4,400千円 (直接経費: 4,400千円)
|
|---|
| キーワード | P-450IIIA / 胎児 / 肝臓 / アフラトキシンB_1 / SRalphaプロモーター / デキサメタゾン / チトクロームP-450 / Nuclear polyhedorosis virus / チトクロムPー450 / Pー450IIIA / SF9細胞 / nuclear polyhedorosis virus / umu試験 / 薬物代謝 / チトクロ-ムPー450 / ヒト胎児肝 / 細胞毒性試験 / 転写調節機構 / MCFー7 / Pー450HFLa / Pー450_<NF> |
|---|
| 研究概要 |
1.ヒト胎児型P-450として我々が単離したP-450IIIA7cDNAをSRalphaプロモーターの下流に接続したpM56発現プラスミドを構築した。このプラスミドをヒト乳癌由来細胞であるMCF-7細胞に遺伝子導入を行い、形質転換細胞(M21及びM27)を得た。これらの形質転換細胞を用いて多くのチトクロームP-450の基質として知られているアフラトキシンB_1に対する細胞致死効果を検討した。その結果、親株であるMCF-7では、50%致死量が17.0mug/mlであるのに対し、M21及びM27形質転換細胞では共に1.4mug/mlとなり、約12倍の感受性の増大が認められた。この結果は、MCF-7細胞内で導入されたP-450IIIA7cDNAが機能的に働いていることを示唆するものであった。
2.P-450IIIA7蛋白質を大量に得る目的のために昆虫細胞での発現を試みた。すなわち、nuclear polyhedorosis virus(NPV)にP-450IIIA7cDNAを挿入した組換え体ウイルス(NPVHF1)を作製し、昆虫細胞であるSf9細胞に感染させ、P-450IIIA7蛋白質を過剰に発現する細胞を作製した。全細胞蛋白質1mg当たり約1.10nmolのP-450IIIA7蛋白質が発現しており、アフラトキシンB_1を用いたumu試験の結果、細胞内で発現させたP-450IIIA7蛋白質は、機能的に働いていることを明らかにした。
3.P-450IIIA7(胎児型P-450)遺伝子及びP-450IIIA4(成人型P-450)遺伝子を単離し、その構造を解析した。その結果、共に13エクソンが20kb以上にわたり散在しており、非常に良く似た遺伝子構造であることがわかった。このことは、この2個の遺伝子は、元々1個の遺伝子より分岐したのではないかと推察された。また各々の5′上流配列を決定したところ両遺伝子間には、91%の高い相同性が認められた。
4.ddY系マウス肝臓よりP-450IIIAファミリーに属するcDNAの単離を試みた。その結果、新規のP-450IIIA分子種を2種類を得ることに成功し、それぞれをP-450IIIA_<M1>及びP-450IIIA_<M2>と命名した。P-450IIIA_<M1>は、マウス肝臓に常在型であり、その発現は、デキサメタゾンの投与で著しく増大された。一方P-450IIIA_<M2>は、肝臓においてその発現は殆ど見られなかった。
|
