| 研究課題/領域番号 |
02454489
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| 研究種目 |
一般研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
生物系薬学
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| 研究機関 | 理化学研究所 |
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研究代表者 |
花岡 文雄 理化学研究所, 細胞生理学研究室, 主任研究員 (50012670)
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| 研究分担者 |
菅澤 薫 理化学研究所, 細胞生理学研究室, 研究員 (70202124)
宮沢 宏 理化学研究所, 細胞生理学研究室, 研究員 (40183967)
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| 研究期間 (年度) |
1990 – 1991
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| 研究課題ステータス |
完了 (1991年度)
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| 配分額 *注記 |
2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
1991年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
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| キーワード | SV40ウイルス / ミニ染色体 / 無細胞複製系 / ヌクレオソ-ム / DNAトポイソメラ-ゼ / 紫外線 / 無細胞修復系 / 色素性乾皮症 / SV40DNA / ス-パ-ヘリックス |
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| 研究概要 |
まず我々が既に確立している、HeLa細胞粗抽出液を用いたSV40ウイルスのミニ染色体無細胞複製系を発展させ、精製蛋白質による複製系を確立した。この系はヒストンとして、鋳型DNAに結合している親ヌクレオソ-ムしか含まれないことから、親鎖DNAに結合していたヒストンの、複製時における挙動を調べるのに好適であった。そのような実験の結果、(1)親鎖DNAに結合していたヒストンは、複製時にもDNAからほとんど遊離しないこと、(2)それらのヒストンは、リ-ディング鎖とラギング鎖にほぼランダムに分布すること、(3)裸のDNAを鋳型にする場合と比較し、DNAトポイソメラ-ゼIIの要求性が異なり、SV40ミニ染色体の複製においては、topoIIは、いわゆるswivelaseとして機能すること、などが判明した。
一方、SV40ミニ染色体に紫外線照射したものを鋳型にして、無細胞染色体修復系の構築を試みた。放射標識した基質とATPの存在下、鋳型なHeLa細胞の粗抽出液と反応させ、DNAを抽出後、アガロ-スゲル電気泳動にかけ、オ-トラジオグラフィ-によって修復合成を検出した。反応液中に紫外線照射しない裸のプラスミドDNAを適当量共存させることにより、紫外線照射したSV40染色体としなかったものとで10倍以上の放射能取り込みの差が得られた。この紫外線損傷依存性のDNA合成は、色素性乾皮症の相補性群AおよびCに属する細胞の抽出液を用いた場合には、HeLa細胞抽出液を用いた場合のそれぞれ1/10および1/3程度であり、両者を混合することにより取り込みが回復した。今後、この無細胞系は、クロマチンのDNA損傷の修復機構解析に有用であろう。
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