| 研究課題/領域番号 |
02556013
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| 研究種目 |
試験研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
応用生物化学・栄養化学
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
谷澤 克行 大阪大学, 産業科学研究所, 助教授 (20133134)
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| 研究分担者 |
柴野 裕次 サントリー株式会社, 基礎研究所, 副参事研究員
多賀谷 光男 大阪大学, 産業科学研究所, 助手 (30179569)
福井 俊郎 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (90029843)
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| 研究期間 (年度) |
1990 – 1992
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| 研究課題ステータス |
完了 (1992年度)
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| 配分額 *注記 |
5,300千円 (直接経費: 5,300千円)
1992年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
1991年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
1990年度: 2,800千円 (直接経費: 2,800千円)
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| キーワード | DNAポリメラーゼ反復反応(PCR) / DNA組換え技術 / 部位特異的変異導入法 / cDNA / ランダムプライマー / 制限酵素切断部位 / ホスホリラーゼ / 基質特異性 / 制限酵素 / DNAポリメラ-ゼ反復反応(PCR) / アデニル酸キナ-ゼ / UDP-グルコ-スピロホスホリラ-ゼ / ランダムプライマ- / アスパラギン酸トランスアミナ-ゼ |
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| 研究概要 |
高度耐熱性DNAポリメラーゼの反復反応(Polymerase chain reactio,PCR)を利用すると、極微量の特定の遺伝子を10万倍以上に増幅 ることができる。本研究は、このPCR法をより積極的に応用して、これまで遺伝子組換えの際に必須であったゲノムDNAのライブラリーやcDNAライブラリーを作成することなく、目的遺伝子のみを特異的に増幅しクローニングする簡便な方法や、制限酵素切断部位に関係なくDNA断片を連結または削除する方法、さらに任意の部位にヌクレオチドの置換、挿入、欠失などの変異を導入する新しい方法を開発することを目的とした。特に、人為的変異導入においては、1回の操作により全てのコドンに対応する変異遺伝子を一挙に作成する方法の確立を目指した。平成2年度〜平成4年度の研究成果の概要は以下の通りである。
1)好熱菌のアスパラギン酸トランスフミナーゼの活性部位リジン残基を変異導入の標的部位として、PCR法により1回のクローニング操作で同時に20種類のアミノ酸残基に置換する新しい方法を開発した。
2)高等植物のUDP-グルコースピロホスホリラーゼのcDNAを鋳型として、構造遺伝子部分をPCR法で増幅して大腸菌内高発現プラスミドを構築した。プライマー中に新規制限酵素部位を容易に導入できた。
3)動物アデニル酸キナーゼの基質結合部位にPCR法でランダムに変異を導入し、種々の変異型酵素の迅速なスクリーニング法を確立した。
4)基質特異性や細胞内局在性を異にする高等植物α-グルカンホスホリラーゼの2種のアイソザイムcDNA中の種々の領域をPCRによって増幅し、増幅DNA断片を連結することにより両アイソザイムのキメラ酵素を構築した。キメラ酵素は元の酵素のいずれよりも非常に高い基質に対する親和性を示すことが判明した。
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