| 研究課題/領域番号 |
02557013
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| 研究種目 |
試験研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
医化学一般
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
額田 敏秀 東京大学, 医学部(医), 講師 (80189349)
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| 研究分担者 |
田中 真人 三菱生命科学研究所, 生体分子科学研究部, 主任研究員
佐藤 尚武 三菱生命科学研究所, 生体分子科学研究部, 主任研究員
芳賀 達也 東京大学, 医学部, 教授 (30011646)
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| 研究期間 (年度) |
1990 – 1992
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| 研究課題ステータス |
完了 (1992年度)
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| 配分額 *注記 |
14,200千円 (直接経費: 14,200千円)
1992年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
1991年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
1990年度: 11,000千円 (直接経費: 11,000千円)
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| キーワード | G蛋白質 / 単クローン抗体 / cDNAクローニング / 免疫グロブリン / ホスホリパーゼC / バキュロウィルス / ムスカリン受容体 / 百日咳毒素 / 免疫ブロッティング / 単クロ-ン抗体 / cDNAクロ-ニング / ホスホリパ-ゼC / ウェスタンブロッティング / ムスカリン性アセチルコリン受容体 |
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| 研究概要 |
1.ウシ肝蔵cDNAライブラリーより2種の新しいG蛋白質αサブユニット(GL1αとGL2αと命名)のcDNAクローニングを行い、ヌクレオチド配列の解析によりアミノ酸一次構造を決定した。2.培養細胞及びアフリカツメガエル卵母細胞を用いたG蛋白質cDNAの発現系を確立し、Gi3αによるCa^<2+>チャンネルの抑制、GL1αとGL2αによるホスホリパーゼCの抑制性と促進性制御を明らかにした。3.細胞融合法を用いて、G蛋白質αサブユニット(GL1α・GL2α・Gila・Goα)に対する単クローン抗体を産生する細胞をクローン化した。4.3で得られた各単クローン抗体の重鎖(γ1・μ)及び軽鎖(κ)に対するcDNAを、Polymerase Chain Reaction法及びcDNAライブラリーのスクリーニングでクローニングし、ヌクレオチド配列解析から重鎖と軽鎖の可変領域に対するアミノ酸一次構造を決定した。5.抗体重鎖と軽鎖cDNAが、分泌蛋白質として大腸菌で同時に発現できるファージ・ベクターを構築した。これを用いると、抗GL1α、Gi1α抗体cDNA由来のμ鎖とκ鎖がペリプラズマ中に分泌され、S-S結合を形成してμ_2κ_2の4量体となることが分かった。6.バキュロウィルスとSf9細胞を用いたG蛋白質αサブユニットの大量発現系を確立した。またGL1α、GL2αが、G蛋白質β1γ2サブユニットと同時にSf9細胞内で発現させることにより可溶化することを明らかにした。7.PCR法でクローニングした単クローン抗体cDNAを、マウス乳癌ウィルス或いはショウジョバエ熱ショック蛋白質プロモーターを有する発現ベクターに組み換えた。今後は、各々のG蛋白質αサブユニットが発現している培養細胞に、それぞれ重鎖と軽鎖cDNAを組み込んだ発現ベクターを共トランスフェクションし、デキサメサゾン或いは熱ショックでプロモーター活性を誘導して細胞内に抗体蛋白質を発現させ、この時に生ずる細胞内変化を検討していく予定である。
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