| 研究課題/領域番号 |
02557098
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| 研究種目 |
試験研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
医学一般
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
野島 博 大阪大学, 微生物病研究所, 助教授 (30156195)
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| 研究分担者 |
井上 浩明 東洋紡生化学研究所, 研究員
小野 泰子 大阪大学, 微生物病研究所, 文部技官 (70194602)
岡崎 孝映 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (70213923)
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| 研究期間 (年度) |
1990 – 1992
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| 研究課題ステータス |
完了 (1992年度)
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| 配分額 *注記 |
13,500千円 (直接経費: 13,500千円)
1992年度: 2,800千円 (直接経費: 2,800千円)
1991年度: 2,600千円 (直接経費: 2,600千円)
1990年度: 8,100千円 (直接経費: 8,100千円)
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| キーワード | コンピタントヤル / エレクトロポレーション / cDNA / ライブラリー / ベクター / PCR法 / 平均鎮長 / ベクタープライマー / コンピタントセル / 平均鎖長 / 機能相補 / 発現クロ-ニング / cDNAライブラリ- / ベクタ- / 制限酵素 / マルチクロ-ニングサイト / 分裂酵母 / 変異株 / mRNA / pcD2系 / OkayamaーBerg法 / f1 ori / T7プロモ-タ- |
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| 研究概要 |
本年度はこれまでに作製してきたベクターを用い実際に高品質のcDNAライブラリーを作製してきた。まず作製にあたり、従来本研究の初年度において我々が開発してきたコンピタントセルを用いてのcDNAライブラリーを作製するよりエレクトロポレーション法による方がよりサイズの長いプラスシドDNAが取り込まれることを本年度に見い出した。ところがライゲース混液はこの方法には不適であり、エタノール沈澱などの処理も有効でない。そこで我々は、熱変性・フェノール処理・フィルター処理を行うことでこの困難を克服しうることを見い出し、これによって〜10^<10>ctu/pBR_<322>の高効率をそのまま利用しうることが可能となった。
cDNAライブラリー作製法は2つの方法論を改善した。ひとつは我々が“自己閉環法"と呼んでいるもので、ベクタープライマーにCテイルを施し、その後BsfXIで切断してG_4を突出させて、そのまま閉環する方法である。ベクターのマルチクローニングサイトを有効に利用し、フィルター処理をうまく用いることによって簡便、迅速に高品質のcDNAライブラリーが作製できるようになった。たとえば5μgのmRNAからスタートして平均鎮長1〜2Kbの1.2×10^6〜4.8×10^7ctuの独立級クローンを持つcDNAライブラリーを作製できた。
我々がリンカープライマー法と呼んでいる方法はもっと効率が良い。これはGubler-Hottman法を改善したものであるが、彼らの方法の欠点はほぼ解消してある。この方法を用い作製したcDNAライブラリーは、1μg相当のmRNAについて平均鎮長約1、8Kbの6.2×10^7ctuの独立クローンを持つ.また1種のcDNAインサートを何種類ものベクターに〓〓に入れられるのも便利な点である.この効率は20ng程度のpoly(A)^+RNAから100万個の独立クローンを持つcDNAライブラリーをPCR法を〓さずに作製できることを示し、その可能性が広がったと思う。
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